姜黄素对LPS和IFN-γ诱导的M1型巨噬细胞脂质转运及炎症的影响

陈方圆,田 刚,郭 宁,周 娟,李娟利,袁祖贻

(西安交通大学医学院第一附属医院心血管内科,西安 710061;*通讯作者,E-mail:chenfy-608@163.com)

动脉粥样硬化为一种慢性炎症性疾病,其特征表现为巨噬细胞的清道夫受体摄取脂质后进一步损伤动脉内膜并形成脂质核心[1]。体外研究表明,巨噬细胞通过其表面清道夫受体CD36和SRA吞噬75%-90%的氧化低密度脂蛋白(oxLDL)而形成泡沫细胞,同时巨噬细胞也能通过脂质转运蛋白(ABCA1、ABCG1及SRB)或其他机制将细胞内积聚的胆固醇酯和磷脂转运至载脂蛋白AI(apoAI),从而平衡脂质流入流出、避免巨噬细胞内过高脂质负荷[2],进一步预防动脉粥样硬化的发生发展[3]。研究发现,在不同的细胞因子和环境条件影响下,巨噬细胞能极化成两种不同的表型,促炎表型M1型和抗炎表型M2型。进展期斑块及不稳定斑块中主要为M1巨噬细胞表达,M1表型巨噬细胞高表达IL-1β、IL-6、iNOS;而M2型巨噬细胞在稳定斑块中表达增加[4],M2表型巨噬细胞高表达Arg和FIZZ。两型巨噬细胞表达与脂质转运有关的受体及蛋白亦不同,M1型巨噬细胞CD36表达减少,而M2型巨噬细胞CD36表达增多,两型巨噬细胞的ABCA1表达均减少[5,6]。但两型巨噬细胞脂质转运能力尚未见相关文献报道。

姜黄素是来源于植物姜黄根茎部的多元酚,为中药姜黄的主要活性成分[7]。姜黄被用来治疗疾病已有4 000年历史。动物研究发现,姜黄素可降低主动脉的脂质斑块面积,有效延缓动脉粥样硬化斑块的发生和发展[8]。姜黄素可以通过调控肝脏脂蛋白胆固醇代谢从而抑制动脉粥样硬化发生发展[9]。然而,姜黄素在调节促炎表型M1巨噬细胞胆固醇的摄取和流出中的作用及其机制尚不清楚。本研究拟观察姜黄素对oxLDL刺激的M1型巨噬细胞CD36和ABCA1表达、脂质流入/流出和炎症反应的影响,并探讨其可能机制。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

DMEM高糖培养基及胎牛血清(美国,Hyclone公司);姜黄素、脂多糖(LPS)、噻唑蓝(MTT)、GW9662(过氧化物酶体增值物激活受体γ阻断剂,PPARγ)(美国,Sigma公司);γ干扰素(IFN-γ)(美国,Peprotech公司);TNF-α和MMP-9 ELISA试剂盒(美国,Ebioscience公司);总RNA提取试剂盒(上海,飞捷公司);逆转录试剂盒及real time PCR试剂盒(大连,Takara公司);兔抗CD36抗体(美国,Abnova公司)、兔抗ABCA1抗体(美国,Novus公司)、兔抗PPARγ(过氧化物酶体增殖激活物受体γ)抗体(美国,Santa cruz公司)、兔抗GAPDH抗体(美国,Proteintech公司)、抗兔二抗(美国,Santa cruz公司);BODIPY和NBD胆固醇(美国,Life公司);apoAI(美国,Millipore公司);油红O(美国,Sigma公司);oxLDL(北京,协生科技公司)。

1.2 细胞培养和诱导

RAW264.7巨噬细胞(M0)置于含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中,37 ℃、5% CO2培养,每48 h更换培养基1次。待细胞融合至75%-85%时,用于后续实验。LPS(100 ng/ml)和IFN-γ(2.5 ng/ml)干预RAW264.7巨噬细胞(M0)12 h诱导巨噬细胞呈炎症表型M1巨噬细胞。

1.3 MTT法检测巨噬细胞细胞活力

将RAW264.7巨噬细胞按每孔2 000个细胞数接种于96孔板,按照前述(详见1.2)细胞培养条件培养至细胞贴壁后,分别给予姜黄素0,6.25,12.5,25,30,50 μmol/L浓度干预6,12,24 h。吸去培养液,每孔加入MTT(5 g/L)20 μl,37 ℃孵育4 h，弃去上清，每孔加入二甲基亚砜100 μl，避光37 ℃摇床10 min，全自动酶标仪检测490 nm处各孔的吸光值。

1.4 实验分组及干预条件

①不同浓度姜黄素(0,6.25,12.5 μmol/L)干预前述方法诱导的M1巨噬细胞12 h，这些处理组分别以M1、6.25M1、12.5M1表示，在研究中这种处理方式代表不同浓度姜黄素(0,6.25,12.5 μmol/L)干预M1表型巨噬细胞；②不同浓度姜黄素(0,6.25,12.5 μmol/L)和oxLDL(30 mg/L)干预诱导成的M1巨噬细胞24 h；③不同浓度姜黄素(0,6.25,12.5 μmol/L)和NBD胆固醇与Apo-AI干预诱导成的M1巨噬细胞14 h；④另取12.5 μmol/L姜黄素和20 μmol/L PPARγ抑制剂GW9662与oxLDL(30 mg/L)或NBD胆固醇与Apo-AI共同干预诱导成的M1巨噬细胞作为对照组。这些处理组分别以M1+oxLDL、6.25M1+oxLDL、12.5M1+oxLDL和12.5M1+oxLDL+GW9662表示；在研究中这种处理方式代表不同浓度姜黄素(0,6.25,12.5 μmol/L)干预oxLDL刺激的M1表型巨噬细胞。另设M0+oxLDL组代表仅用oxLDL(30 mg/L)干预RAW264.7巨噬细胞。

1.5 ELISA测定上清中TNF-α和MMP-9的表达

经上述干预条件①和②干预后的巨噬细胞，收集细胞上清。依据试剂盒操作说明，使用ELISA试剂盒测定各组TNF-α和MMP-9的分泌，使用自动酶标仪在450 nm处读取数值。

1.6 real time PCR测定mRNA相对水平

经上述干预条件①和②干预后的巨噬细胞，根据试剂盒说明提取总RNA，用紫外分光光度法测定RNA的纯度与浓度。按照逆转录试剂盒操作步骤将各组mRNA反转录为cDNA。按照real time PCR试剂盒步骤进行实验，PCR扩增条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s共计40个循环。基因表达定量采用双δ方法(2δδCt)。由北京奥科公司合成引物，序列见表1。

表1 引物序列

Table 1 Primer sequences for PCR

基因序列 IL-1β上游:5′-GTCACAAGAAACCATGGCACAT-3′下游:5′-GCCCATCAGAGGCAAGGA-3′IL-6上游:5′-CTGCAAGAGACTTCCATCCAGTT-3′下游:5′-AGGGAAGGCCGTGGTTGT-3′GAP-DH上游:5′-AGCAGTCCCGTACACTGGCAAAC-3′下游:5′-TCTCCTGTAAATGTAGTGGTGTCT-3′PPARγ上游:5′-ACGTGCAGCTACTGCATGTGA-3′下游:5′-AGAAGGAACACGTTGTCAGCG-3′CD36上游:5′-ACGTGCAGCTACTGCATGTGA-3′下游:5′-AGAAGGAACACGTTGTCAGCG-3′ABCA1上游:5′-ACGTGCAGCTACTGCATGTGA-3′下游:5′-AGAGGAACACGTTGTCAGCG-3′TNF-α上游:ACGTGCAGCTACTGCATGTGA-3′下游:5′-AGAAGGAACACGTTGTCAGCG-3MMP-9上游:ACGTGCAGCTACTGCATGTGA-3′下游:5′-AGAAGGAACACGTTGTCAGCG-3′

1.7 Western blot检测CD36、ABCA1和PPARγ蛋白表达

经上述干预条件①和②干预后的巨噬细胞用RIPA裂解液裂解提取细胞总蛋白。BCA蛋白定量试剂盒测定各组样品蛋白浓度后加入蛋白上样缓冲液煮沸备用。10% SDS-PAGE分离蛋白，半干转膜仪转膜。一抗浓度：CD36(1 ∶500)、ABCA1(1 ∶500)、PPARγ(1 ∶200)、GAPDH(1 ∶5 000)，以GAPDH作为内参；二抗浓度1 ∶5 000。化学发光法检测，图像采集，Image J软件进行图像分析。

1.8 油红O染色检测巨噬细胞脂质吞噬能力

不同浓度姜黄素(0,6.25,12.5 μmol/L)和oxLDL(30 mg/L)共同干预RAW264.7巨噬细胞(M0)和由LPS和IFN-γ诱导成的M1表型巨噬细胞24 h,其中用或者不用GW9662;PBS清洗3次,用4%多聚甲醛固定30 min,再用油红O染色1 h,苏木精反染30 s,最后光镜下观察巨噬细胞内脂质聚集情况。通过异丙醇提取被染色细胞的油红O,全自动酶标仪检测518 nm吸光值。

1.9 BODIPY荧光染色检测巨噬细胞脂质吞噬能力

不同浓度姜黄素(0,6.25,12.5 μmol/L)和oxLDL(30 mg/L)共同干预RAW264.7巨噬细胞(M0)及经LPS和IFN-γ诱导成的M1表型巨噬细胞24 h,其中用或者不用GW9662;PBS清洗3次,用4%多聚甲醛固定30 min。在室温下避光用BODIPY对细胞进行染色20 min,DIPY反染30 s,仔细清洗掉染色剂,用荧光显微镜观察巨噬细胞内脂质聚集情况。用流式细胞仪检测巨噬细胞内脂质聚集量。

1.10 胆固醇流出实验检测巨噬细胞的脂质流出

不同浓度姜黄素(0,6.25,12.5 μmol/L)和NBD胆固醇(30 mg/L)干预诱导成的M1巨噬细胞6 h,去除上述干预条件后,再用含0.2%BSA的高糖DMEM培养基加不同浓度姜黄素和apoAI干预巨噬细胞8 h,同时取20 μmol/L GW9662与12.5 μmol/L姜黄素共同干预经NBD胆固醇和Apo-AI刺激的M1巨噬细胞。收集上清,13 000 r/min,离心5 min。除去碎片,并用0.1 N NaOH裂解细胞,用荧光显微镜分别测定上清液和裂解细胞的荧光值。apoAI介导的胆固醇流出用下列公式计算:①总的流出率(%)=上清液荧光值/(上清液荧光值+细胞裂解液荧光值);②DMEM介导的特异性流出率(%)=上清液荧光值/(上清液荧光值+细胞裂解液荧光值);③apoAI介导的胆固醇流出率(%)=总的流出率(%)-DMEM介导的特异性流出率(%)。

1.11 统计学分析

使用SPSS13.0软件进行统计学分析,计量资料用均数±标准差表示。组间比较采用单因素方差分析。P<0.05表示差异具有统计学意义。所有试验均进行3次。

2 结果

2.1 姜黄素对RAW264.7巨噬细胞活力的影响

如图1所示,50 μmol/L姜黄素干预6 h细胞活力为75%,30 μmol/L姜黄素干预12 h细胞活力为75%,25 μmol/L姜黄素干预24 h细胞活力为80%。0-25 μmol/L姜黄素干预6 h和12 h对细胞活力无明显影响(P>0.05)。0-12.5 μmol/L姜黄素干预12 h和24 h对细胞活力无明显影响(P>0.05)。故选取6.25 μmol/L和12.5 μmol/L姜黄素干预细胞12 h和24 h作为后续实验条件。

2.2 姜黄素对M1表型巨噬细胞表达CD36、ABCA1、PPARγ和炎症因子的影响

不同浓度姜黄素均能降低促炎M1表型巨噬细胞炎症因子IL-6和IL-1β的mRNA表达,降低CD36、ABCA1、PPARγ水平(P<0.05,见图2);姜黄素能使M1表型巨噬细胞CD36、ABCA1、PPARγ在蛋白水平和mRNA水平均表达上调,且不同浓度间差异有统计学意义(P<0.05,见图3,4)。

与0 μmol/L比较,*P<0.05图1 姜黄素对RAW264.7巨噬细胞活力的影响Figure 1 Effect of curcumin on cell vitality of RAW264.7 macrophages

与M0比较,*P<0.05;与M1比较,#P<0.05;6.25M1和12.5M1分别为6.25，12.5 μmol/L姜黄素处理M1细胞图2 姜黄素在RNA水平对M1表型巨噬细胞表达IL-6、IL-1β、CD36、ABCA1和PPARγ影响Figure 2 Effect of curcumin on mRNA levels of IL-6, IL-1β, CD36, ABCA1 and PPARγ in M1 subset macrophages

与M0比较,*P<0.05;与M1比较,#P<0.05;6.25M1和12.5M1分别为6.25，12.5 μmol/L姜黄素处理M1细胞图3 姜黄素在蛋白水平对M1表型巨噬细胞表达CD36、ABCA1和PPARγ的影响Figure 3 Effect of curcumin on protein expression of CD36, ABCA1 and PPARγ in M1 subset macrophages

与M0+oxLDL比较,*P<0.05;与M1+oxLDL比较,#P<0.05;与12.5M1+oxLDL比较,△P<0.05;6.25M1和12.5M1分别为6.25，12.5 μmol/L姜黄素处理M1细胞图4 姜黄素通过活化PPARγ使oxLDL刺激的M1表型巨噬细胞内脂质聚集增加Figure 4 Curcumin increases the lipid accumulation in M1 subset macrophages stimulated by oxLDL via the PPARγ activation

2.3 姜黄素对oxLDL干预的M1表型巨噬细胞CD36表达及胆固醇聚集的影响

用oxLDL干预M0巨噬细胞和M1巨噬细胞,与M0巨噬细胞相比,M1表型巨噬细胞CD36表达下调,且细胞内脂质聚集减少(见图4);不同浓度姜黄素干预oxLDL刺激的M1表型巨噬细胞后,CD36表达上调,且细胞内脂质聚集和泡沫细胞形成增加,且不同浓度间差异有统计学意义(P<0.05,见图4);当加入PPARγ阻断剂GW9662后,这个作用被抑制,CD36表达降低(见图5),并且细胞内脂质聚集减少,各组间差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.4 姜黄素通过活化PPARγ-ABCA1通路增加M1表型巨噬细胞胆固醇流出

NBD胆固醇刺激后的M1表型巨噬细胞ABCA1表达下调,apoAI介导的胆固醇流出减少(P<0.05,见图6),姜黄素则能上调NBD胆固醇刺激后的M1表型巨噬细胞ABCA1表达,且能使apoAI介导的胆固醇流出增加,具有浓度依赖性(见图6);当加入PPARγ阻断剂GW9662后,上调的ABCA1表达及又降低,apoAI介导的增加的胆固醇流出又减少(P<0.05,见图6)。

与M0+oxLDL比较,*P<0.05;与M1+oxLDL比较,#P<0.05;与12.5M1+oxLDL比较,△P<0.05;6.25M1和12.5M1分别为6.25，12.5 μmol/L姜黄素处理M1细胞图5 姜黄素通过活化PPARγ使oxLDL刺激的M1表型巨噬细胞CD36蛋白表达增加Figure 5 Curcumin increases the protein expression of CD36 in M1 subset macrophages stimulated by oxLDL via the PPARγ activation

与M0比较,*P<0.05;与M1比较,#P<0.05;与M1+NBD胆固醇比较,△P<0.05;6.25M1和12.5M1分别为6.25，12.5 μmol/L姜黄素处理M1细胞图6 姜黄素通过活化PPARγ上调M1表型巨噬细胞ABCA1蛋白表达及促进胆固醇流出Figure 6 Curcumin increases the protein expression of ABCA1 and lipid influx in M1 subset macrophages via the PPARγ activation

2.5 姜黄素减少oxLDL刺激的M1表型巨噬细胞炎症因子的表达

在RNA和蛋白水平上,姜黄素均能减少M1源性泡沫细胞TNF-α和MMP-9炎症因子的表达。虽然姜黄素能使M1表型巨噬细胞胆固醇酯聚集增加促进泡沫细胞形成,但是同时也能减轻此种泡沫细胞的炎症反应。各组间差异具有统计学意义(P<0.05,见图7)。

3 讨论

动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病,巨噬细胞参与其发生发展的全过程[10]。在这些过程中,血管局部的炎症因子及微环境诱导浸润的巨噬细胞转变成M1型炎症型巨噬细胞,进一步放大并加剧炎症反应,促进病变进展,修饰的低密度脂蛋白损伤并沉积在血管壁被巨噬细胞吞噬进一步加剧病变诱导粥样斑块破裂发生急性事件[11]。既往研究报道,姜黄素能降低炎症因子诱导的巨噬细胞的炎症反应,能抑制oxLDL诱导的巨噬细胞及血管平滑肌细胞促炎因子产生,能调节血脂,并能抑制apoE小鼠动脉粥样病变的发生及发展[12],但是对不同炎症表型的巨噬细胞的脂质代谢能力的影响尚未见报道。本研究主要关注姜黄素对促炎型M1巨噬细胞的脂质代谢的影响,在体外研究上为姜黄素抗动脉粥样硬化提供一些线索。

研究结果表明,M1型巨噬细胞及经oxLDL刺激的M1型巨噬细胞均高表达促炎因子IL-6、IL-1、MMP-9和TNF-α,低表达PPARγ、CD36和ABCA1,说明其对有害脂蛋白的处理能力低下,两者能进一步加剧血管壁损伤及炎症反应。姜黄素能减轻M1型巨噬细胞以及由oxLDL刺激的M1型巨噬细胞的炎症反应,并且能增加上述两种M1型巨噬细胞CD36、ABCA1和PPARγ表达。既往研究报道,姜黄素是PPARγ的天然活化剂,PPARγ活化后具有抗炎、抗氧化及调节脂质代谢的能力[13]。M1型巨噬细胞及经oxLDL刺激的M1巨噬细胞PPARγ表达较低,姜黄素干预后能活化PPARγ,活化后的PPARγ可能通过PPARγ-CD36及PPARγ-ABCA1通路增加CD36和ABCA1表达,这个结果表明姜黄素能减少局部炎症反应及增加M1型巨噬细胞对有害脂蛋白的处理能力。

研究结果表明姜黄素能增加oxLDL刺激的M1型巨噬细胞CD36的表达,同时也能增加ABCA1的表达,故增加M1型巨噬细胞胆固醇的流入及泡沫细胞形成,同时姜黄素也能增加M1型巨噬细胞脂质流出,增加M1型巨噬细胞对有害脂蛋白的清除能力,减轻修饰的脂蛋白对血管壁的损伤。这个结果考虑可能与姜黄素活化PPARγ有关。因为我们在姜黄素及oxLDL干预的M1型巨噬细胞中加入PPARγ阻断剂GW9662时,CD36、ABCA1表达降低,而且脂质流入流出均受抑制。这与既往研究结果一致。修饰的脂蛋白例如oxLDL能触发许多促动脉粥样硬化反应通过增加循环的炎症细胞,因此,去除血管壁微环境中修饰的低密度脂蛋白是有益处的[14]。巨噬细胞通过清道夫受体识别和摄取炎症脂蛋白分子,同时巨噬细胞也能通过胆固醇转运机制清除聚集的脂质。越来越多的证据表明巨噬细胞通过清道夫受体摄取胆固醇形成泡沫细胞可能不促进动脉粥样硬化,而是对动脉粥样硬化具有保护作用[15]。而且,ABCA1介导的脂质流出是对巨噬细胞里脂质负荷过重的保护机制,也能抑制动脉粥样硬化的进展[16]。研究结果表明,姜黄素通过增加oxLDL刺激的M1型巨噬细胞的CD36、ABCA1表达,从而增加了M1型巨噬细胞脂质处理能力,进一步说明了姜黄素的抗动脉粥样硬化能力。

与M0比较,*P<0.05;与M1比较,#P<0.05;与M1+oxLDL比较,△P<0.05;6.25M1和12.5M1分别为6.25，12.5 μmol/L姜黄素处理M1细胞图7 姜黄素减少oxLDL刺激的M1表型巨噬细胞炎症因子的表达Figure 7 Curcumin reduces the expression of inflammatory cytokines in M1 subset macrophages stimulated by oxLDL

血管局部炎症能损伤血管壁并且促进动脉粥样硬化发生发展[17]。研究结果表明,姜黄素能降低M1型巨噬细胞炎症,降低炎症因子表达,并且能降低oxLDL刺激的M1型巨噬细胞的炎症,降低TNF-α及MMP-9炎症因子表达,既往研究均表明这些炎症因子都有促进动脉粥样硬化发生发展的作用。而且这个结果与既往研究一致,并且与姜黄素的抗炎作用是一致的。

姜黄素通过活化PPARγ增加oxLDL刺激的M1型巨噬细胞CD36表达,增加脂质聚集及M1型巨噬细胞源性泡沫细胞形成,同时也能通过活化PPARγ增加oxLDL诱导的M1型巨噬细胞ABCA1表达,增加脂质流出;并且姜黄素能减轻oxLDL诱导的M1型巨噬细胞的炎症反应。以上结果均表明姜黄素能增加M1型巨噬细胞的脂质处理能力、清除有害脂质及减轻有害脂质对血管壁的损伤,并且减轻促动脉粥样硬化的炎症反应,在细胞水平上为姜黄素的抗动脉粥样硬化作用提供进一步证据。