2017年绍兴地区106株非结核分枝杆菌菌种鉴定结果分析

金法祥 陶学芳 王华钧 许文芳 陈雪芳

非结核分枝杆菌(non-tuberculous mycobacteria，NTM)是一种环境生长菌，目前已鉴别出175种和13个亚种 (http://www.bacterio.net/mycobacterium．html),对人体具有致病性的有40余种[1]。NTM 可以侵犯人体肺脏、淋巴结、骨骼、关节、皮肤和软组织等，并可引起全身播散性疾病。NTM感染肺脏，引起肺部病变称为非结核分枝杆菌肺病。NTM感染的高危人群主要是慢性呼吸道疾病患者(慢性阻塞性肺疾病、肺结核残余空洞、尘肺、支气管扩张等)、老年人和免疫功能缺陷者，特别是艾滋病(AIDS)患者。近年来，人口老龄化及其免疫力降低，各种免疫抑制剂的使用、AIDS的流行及医原性感染机会增多、环境污染等诸多因素导致NTM 病呈快速增多趋势[1]，并已成为威胁人类健康的重要公共卫生问题。NTM对人致病，90%以上发生NTM肺病；美国研究数据显示，65岁以上的老年人肺部NTM感染的年发病率由1997年的20/10万增加到2007年的47/10万[2]。随着现代医疗技术的不断提高、NTM菌种鉴定技术的进步，以及免疫抑制剂使用等因素，临床分离培养到NTM及其相关的疾病呈增多趋势[3-4]。本研究对绍兴地区2017年临床分离的972株分枝杆菌进行菌种鉴定，了解本地区NTM的优势菌群，为NTM病的诊疗提供科学依据。

资料和方法

一、菌株来源

2017年绍兴市立医院(现为绍兴文理学院附属医院)采用BACTEC MGIT 960全自动分枝杆菌培养仪，绍兴市中心医院、诸暨市人民医院、上虞市人民医院、新昌县人民医院采用BACTEC MGIT 320全自动分枝杆菌培养仪，共液体培养分离分枝杆菌972株。结核分枝杆菌(MTB)标准株H37Rv(ATCC27294)来源于中国疾病预防控制中心结核病参比室传代培养。胞内分枝杆菌(ATCC13950)、鸟分枝杆菌(ATCC25291)、堪萨斯分枝杆菌(ATCC12478)菌株来源于中国医学细菌保藏管理中心。

二、试剂、仪器与操作

(一)试剂、仪器

分枝杆菌液体培养基由美国BD公司提供，结核分枝杆菌抗原检测试剂盒(胶体金法)购自杭州创新生物检控技术有限公司，分枝杆菌菌种鉴定试剂盒由北京博奥生物集团有限公司提供。

日本奥林巴斯显微镜，美国Thermo Fisher Scientific公司低温高速离心机，上海Heal Force B2生物安全柜，杭州创新科技公司PCR扩增仪，HybSet 微阵列芯片杂交仪、芯片洗干仪、微阵列芯片扫描仪(LuxScan 10K-B)均由北京博奥生物集团有限公司提供。

(二)操作方法

1.核酸提取：将核酸提取管采用离心半径 8 cm，12 000 r/min 离心 1 min，备用；将1 ml NTM菌液加入到1.5 ml 的离心管中，离心半径 8 cm，12 000 r/min 离心 10 min，弃上清液；向离心管中加入 1 ml 0.9%氯化钠溶液，涡旋振荡混匀，离心半径 8 cm，12 000 r/min 离心 10 min，弃上液清；用移液器将离心管中剩余液体吸干；每个离心管中加入 50 μl NTM菌种鉴定核酸提取液，用移液器吹吸沉淀，将液体和沉淀一起转移到核酸提取管中，涡旋充分振荡混匀5 min；将核酸提取管置于 95 ℃金属浴10 min；离心半径 8 cm，12 000 r/min 离心 1 min，备用。

2.PCR扩增：取出PCR反应管，采用离心半径 8 cm，5000 r/min 离心2 s，将PCR扩增试剂按18 μl/管分装，加入已提取的待测标本DNA 2 μl，同时取2个PCR反应管分别加入MTB阳性质控品和MTB阴性质控品。扩增条件：37 ℃ 5 min， 94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s×35次，94 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s×10次，72 ℃延伸10 min，保持4 ℃。

3.芯片杂交：PCR 产物置于 PCR 仪中 95 ℃变性 5 min， 随后置于冰水混合物中5 min；按照 9 μl杂交液、6 μl PCR 产物的比例配制杂交混合液；在基因微阵列芯片杂交盒的底部加入 200 μl蒸馏水，将托架放入盒体内的2个定位柱之间，芯片正面向上，盖片4个凸台向下盖在芯片上；吸取 13.5 μl杂交混合液经加样孔加入芯片点阵中，盖好盒盖并用金属条密封杂交盒；将杂交盒平稳放入杂交仪托盘，以使托盘平衡；运行分枝杆菌菌种鉴定杂交程序，杂交条件为 50 ℃杂交 120 min。

4. 芯片洗涤：根据芯片数量配制洗涤液Ⅰ和洗涤液Ⅱ，体积以洗涤时能完全浸没芯片为准。洗涤液Ⅰ：依次将蒸馏水、20×SSC(saline sodium citrate)、10%十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS) 按 88∶10∶2 的比例配置 500 ml并混合；洗涤液Ⅱ：依次将蒸馏水、20×SSC 按 99∶1 的比例配置1000 ml并混合；预热芯片洗干仪，待仪器屏幕显示“请放入芯片进行洗涤”的对话框时即可放入完成杂交的芯片，运行分枝杆菌菌种鉴定芯片洗涤程序进行洗涤。

5. 扫描判读：使用LuxScanTM10微阵列芯片扫描仪。开启扫描仪，运行分枝杆菌菌种鉴定芯片判读系统，点击激光控制按钮，预热 10 min；输入芯片编号、标本编号等相关信息； 将芯片放入扫描仪插槽内，点击“开始检测”按钮进行芯片扫描，结果将在屏幕上显示并自动保存；1张芯片扫描完毕后继续重复下一张芯片的扫描；完成全部操作后，关闭激光，退出软件，关闭扫描仪，详细记录判读结果和芯片信息。

三、分枝杆菌菌种初步鉴定

分枝杆菌培养采用液体快速培养法，BACTEC MGIT 960全自动分枝杆菌培养仪报阳性，培养液经涂片抗酸染色确认，为分枝杆菌培养阳性。分枝杆菌阳性菌液初步鉴定结核分枝杆菌复合群和 NTM，采用MTB抗原检测试剂(胶体金法)。MTB：MTB抗原检测阳性；NTM：MTB抗原检测阴性。

分枝杆菌菌种初步鉴定结果：绍兴地区2017年972株分枝杆菌临床分离株中，经菌种初步鉴定866株为结核分枝杆菌复合群(占89.09%)，106株为 NTM(占10.91%)。106株NTM中，91株分离于痰液标本，14株分离于肺泡灌洗液，1株分离于脓液。

结 果

对确认的106株NTM临床分离株采用DNA微陈列芯片法进行菌种鉴定，采用微阵列芯片扫描仪和相应软件进行信号读取，NTM菌株都获得一张清晰的芯片图，以下列举胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、浅黄分枝杆菌的芯片图(图1)。

通过DNA微阵列芯片法进行菌种鉴定，106株NTM菌株共有14个菌种，菌种数量位列前5位的是胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、龟-脓肿分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌(表1)。

讨 论

近年来，结核病疫情呈下降趋势而NTM病的患病率却逐年上升，甚至可能超过结核病的发病率和患病率[5-6]。加拿大Marras等[7]研究显示，在安大略省NTM患病率从1997年的9.1/10万增加到2003年的14/10万，远远超过安大略省的结核病患病率。在日本，NTM患病率由1971年的0.28/10万上升到1997年的3.52/10万[8]。我国台湾地区NTM病的发病率从2000年的2.7/10万增至2008年的10.2/10万，NTM病占所有分枝杆菌病的比率从2000年的32.3%升至2008年的49.8%，而结核病的比率从2000年的67.7%降至2008年的50.2%[9]。NTM在我国的抗酸染色阳性的分枝杆菌标本中的检出率呈上升趋势[10]。

图1 列举DNA微阵列芯片法对4种NTM菌种进行鉴定的芯片图。从左至右分别为胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、鸟分枝杆菌(M.avium)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、浅黄分枝杆菌(M.gilvum)

表1 106株 NTM 采用DNA微阵列芯片法

目前，在我国部分基层医院，抗酸染色涂片检查是唯一的用来诊断MTB感染的方法，可能有不少NTM的感染者被误诊为MTB感染并接受了错误的抗结核药物治疗[11],既往曾经对MTB具有诊断指导性的抗酸染色,不能鉴别MTB与NTM[12]。NTM致病的显著特点是很强的机会性，人体存在NTM致病的很多机会或条件导致继发NTM肺病，如老年人免疫力下降、慢性支气管炎、支气管扩张、慢性阻塞性肺疾病、恶性肿瘤、血液透析、器官移植，以及使用免疫抑制剂、糖皮质激素等使免疫功能降低的药物、AIDS患者并发的肺部感染中，NTM肺病占第3位，仅次于卡氏肺孢子虫肺炎和巨细胞病毒肺炎[11]，继发NTM感染是导致这些人群预后差和死亡的重要因素。NTM肺病多发生于结构性肺部疾病的基础上，如慢性阻塞性肺疾病、支气管扩张、肺结核、尘肺、肺囊性纤维化等，NTM肺病患者的肺通气功能减退较肺结核更为明显，NTM肺病病程较长、肺组织破坏较重，加上各种并发症的存在，因此NTM感染是慢性呼吸系统疾病患者的噩梦[13]。

我国历次的全国结核病流行病学调查结果显示，NTM的分离率从1990年的4.9%持续增高[3]。随着结核病疫情逐步得到控制，NTM感染在分枝杆菌疾病中所占的比例将逐步提高[4]。NTM分离率各地报道上海为5.9%，福建为10.2%，广东为19.3%[14-16]。本研究结果显示，绍兴市共辖三县三区，此次入选患者来源于我市的6个行政区，以绍兴市区的柯桥区和越城区的NTM就诊患者为主，就诊患者中，绝大多数为住院临床诊断为结核病的患者。上述研究表明，NTM 的流行有着显著的区域性差异。本研究NTM菌种鉴定采用基因芯片法，又称 DNA微阵列芯片法。基因芯片法鉴定NTM全流程只需要8 h，简化了操作，具备鉴定临床常见NTM菌种的能力，能够有效解决临床NTM感染诊断的大部分问题。

NTM 的感染发生率和菌种分布存在着地域差异，且与气候环境相关。具有南方多于北方，气候温和地区多于气候寒冷地区，沿海地区多于内陆地区的特点。绍兴地处浙江省北部，紧靠宁波沿海地区，气候温和。2017年NTM感染患者例数呈增加趋势，且NTM菌种种类达14种。根据宁波地区报道，93株NTM中以胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌和戈登分枝杆菌为主[17]；而湖南省报道的51株 NTM 菌株中以胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌为主[18]。本次研究结果显示，2017年绍兴地区NTM菌种以胞内分枝杆菌为主，其次为鸟分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌，这三类均属于缓慢生长分枝杆菌。胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌系Ⅲ群NTM， 属于不产色素缓慢生长群；菌落均不产生色素，或呈灰白色、淡黄色；鸟-胞内型复合群是NTM肺病最常见的致病菌，尤其常见于免疫功能低下者[19-22]。

临床上，MTB与 NTM 引起的肺病、淋巴结炎等疾病常难以鉴别诊断，很容易误诊。大量研究及临床治疗经验表明，多数传统抗结核药物对 NTM 病很少或没有抗菌活性，为避免临床对NTM 感染患者给予常规抗结核药物治疗而延误病情，准确快速的分枝杆菌菌种鉴定对NTM病的早期诊断和治疗非常重要。目前，国内还没有统一的针对NTM的药物敏感性试验(简称“药敏试验”)的方法，多数医院没有开展针对NTM 的药敏试验，而NTM 病的治疗常采用经验治疗。因此，NTM 菌种鉴定就显得更为重要，以便有针对性地制订化学治疗方案。