吡法齐明抗耐药结核分枝杆菌作用机制的初步研究

张叶 李媛媛 徐建 陈曦 王彬 付雷 陆宇

亚胺吩嗪类药物具有很强的体内外抗结核和抗炎活性作用，以及抑制耐药菌株的较强作用[1]。该类药物中氯法齐明的抗MTB活性已得到证实，并被世界卫生组织推荐为耐多药结核病的二线核心治疗药物[2]，故其结构改造物不断地被合成和筛选[3-4]，其中吡法齐明因活性更强、不良反应更弱而成为我国首个拥有自主知识产权的疗效明确且安全性更高的抗MTB新药[3, 5]。目前，吡法齐明已进入Ⅰ期临床研究，但尚未见该药作用机制的研究报道，对其机制的探讨均基于对氯法齐明的研究，其中细胞内的氧化还原循环是氯法齐明介导的较公认的抗结核作用机制，该理论源于首先合成氯法齐明的Barry等[6]的研究，其认为氯法齐明可能是通过在细胞内发生的氧化还原反应生成大量具有抗菌活性的活性氧而起作用。本研究通过测定氯法齐明和吡法齐明刺激前后菌体内活性氧水平和不同氯法齐明和吡法齐明耐药表型的MTB过氧化氢酶活性，初步探讨其作用机制及过氧化氢酶活性与MTB氯法齐明和吡法齐明耐药表型间的关系。

材料和方法

一、研究材料

1.菌株：以1、2、4、8倍于最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)的氯法齐明和吡法齐明处理H37Rv标准株(ATCC 27294，对氯法齐明和吡法齐明均敏感)24 h，应用荧光探针2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)活性氧检测试剂盒测定药物处理后MTB菌体内的活性氧含量水平，比较不同浓度的氯法齐明和吡法齐明作用前后菌体内活性氧水平变化。以过氧化氢酶活性检测试剂盒测定5株对氯法齐明和吡法齐明均耐药、3株对氯法齐明耐药但对吡法齐明敏感、1株对氯法齐明和吡法齐明均敏感(编号13385)的MTB临床分离株及H37Rv标准株的过氧化氢酶活性，比较氯法齐明和吡法齐明耐药菌株与敏感菌株的过氧化氢酶活性的差异。所有菌株均来源于本研究室保存的300株耐多药菌株，并经MIC筛选后获得。表型药物敏感性试验通过微孔培养显色法(microplate alamar blue assay，MABA)进行测定。

2.仪器与试剂：Tecan Infinite 200多功能酶标仪，Nuaire701二氧化碳恒温培养箱，Thermo ScientificMicro 21R高速冷冻离心机等。吡法齐明对照品(由中国医学科学院药物研究所提供，批号HCⅢⅠ-13701-1)，氯法齐明对照品(上海瀚香生物科技公司，批号20150888)，7H9液体培养基干粉(美国BD公司，批号4099145)，Middlebrook OADC增菌液(美国BD公司，批号6237601)，吐温80(北京索莱宝科技有限公司，批号301C052)，丙三醇(国药集团化学试剂有限公司，批号20180223)，二甲基亚砜(美国VWR公司，批号67-68-5)。活性氧检测试剂盒和过氧化氢酶活性检测试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司。

二、MTB菌体内活性氧含量测定

本研究中使用DCFH-DA试剂盒进行MTB菌体内活性氧检测。具体步骤如下：

1.菌液及药物的配制和探针的稀释：将培养至对数生长期的H37Rv标准株菌液混匀，以7H9培养基将菌液稀释为1×107菌落形成单位(CFU)/ml后，将菌液分装于12个1.5 ml的离心管中，每管1.0 ml。以二甲基亚砜配制氯法齐明和吡法齐明储备液，浓度均为2.4 mg/ml(初始浓度)。以7H9培养基将氯法齐明储备液稀释为0.24 mg/ml(1 MIC)、0.48 mg/ml(2 MIC)、0.96 mg/ml(4 MIC)、1.92 mg/ml(8 MIC)；将吡法齐明储备液稀释为0.06 mg/ml(1 MIC)、0.12 mg/ml(2 MIC)、0.24 mg/ml(4 MIC)、0.48 mg/ml(8 MIC)；将10 mol/L 的荧光探针DCFH-DA稀释1000倍，使其终浓度为10 μmol/L。

2.药物处理：将试剂盒提供的1 μl(1个单位)和5 μl的活性氧阳性对照试剂(分别为1U-Rosup和5U-Rosup)，以及稀释好的各浓度氯法齐明和吡法齐明溶液各1 μl分别加入至其中10个离心管中，作为菌体细胞阳性刺激管；剩余2管作为阴性对照。混匀后将离心管放入含5%CO2的恒温培养箱中37 ℃ 孵育24 h。

3.加载探针：将孵育好的各样品以8000×g离心10 min，弃上清，各管分别加入1 ml浓度为10 μmol/L 的荧光探针DCFH-DA，混匀，置于37 ℃培养箱内孵育20 min，使探针和菌体细胞充分接触。再以7H9培养基洗涤菌体细胞3次，以充分去除未进入菌体细胞内的DCFH-DA。

4.活性氧的测定：分别吸取10管菌体细胞阳性刺激管中菌液各200 μl至96孔板中，每管加入2个微孔；再分别吸取2管阴性对照管菌液、7H9培养基、H37Rv标准株菌液和试剂盒提供的Rosup活性氧阳性对照试剂各200 μl至96孔板中，每管加入2个微孔。使用多功能酶标仪实时检测不同条件刺激后的菌体细胞荧光强度值，设定激发波长为488 nm，发射波长为525 nm。本研究以试剂盒提供的阳性对照试剂Rosup、1U-Rosup、5U-Rosup处理的菌体细胞的荧光强度值作为阳性对照参数，以测定可能影响结果的荧光强度值作为阴性对照参数，包括7H9培养基、H37Rv标准株、H37Rv标准株+DCFH-DA(无药物刺激)。

三、MTB胞内过氧化氢酶活性测定

本研究是利用过氧化氢酶能够分解过氧化氢的反应，以及反应溶液在240 nm下呈现特征性吸收峰，即吸光度值随着反应时间的延长而降低的特性，来测定过氧化氢溶液吸光度值的变化情况以计算过氧化氢酶的活性(CAT)。以H37Rv标准株和两药敏感菌株的过氧化氢酶的活性值作为对照，测定两药耐药菌株的过氧化氢酶活性，以比较耐药株与敏感株的过氧化氢酶活性是否存在差别。

1.MTB粗酶液提取：在适量培养至对数期的MTB[包括H37Rv标准株、13385菌株，以及8株对氯法齐明和(或)吡法齐明耐药菌株]菌液(约5×106个)中加入 1 ml试剂盒提供的过氧化氢酶提取液，使得细菌数量(104个)∶提取液体积(ml)为500∶1。超声波(功率200 W)破碎细菌或细胞3 min，间隔10 s，重复30 次。超声破碎后离心，取上清置于冰上待测。

2.测定样品吸光度值：取过氧化氢酶活性检测试剂盒中1 ml检测工作液(含过氧化氢)于1 ml石英比色皿中，再加入35 μl上一步粗提取样本，混匀5 s；室温下立即测定240 nm下的初始吸光度值A1和1 min后的吸光度值A2，计算ΔA=A1-A2。将每1万个细菌在反应体系中每分钟催化1 nmol过氧化氢降解定义为1个酶活力单位，根据ΔA计算过氧化氢酶活性(U/104cell)，吸光度值越低过氧化氢酶活性越高。根据试剂盒提供的公式，CAT活性(U/104cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=1.356×ΔA。其中CAT活性：过氧化氢酶活性；V反总：反应体系总体积，1.035×10-3L；ε: 过氧化氢摩尔吸光系数，4.36×104L·mol-1·cm-1；d：比色皿光径，1 cm；V样：加入样本体积，0.035 ml；V样总：加入提取液体积，1 ml；T：反应时间，1 min；500：细菌总数，500 万。

四、统计学处理

采用SPSS 19.0软件进行数据的统计学分析，对吡法齐明药物处理浓度与所测得的荧光强度值进行Spearman相关性分析和线性回归分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、 阴阳性对照试剂活性氧的荧光强度值测定结果

本研究以试剂盒提供的阳性对照试剂Rosup、1 U-Rosup和5 U-Rosup处理的菌体细胞的荧光强度值作为阳性对照参数，以测定的可能影响结果的各个组分的荧光强度值作为阴性对照参数，包括7H9培养基、H37Rv标准株、H37Rv标准株+DCFH-DA(无药物刺激)的阴性对照样品，其中7H9培养基、H37Rv标准株的荧光强度值最低，均<500；而H37Rv标准株+DCFH的荧光强度值较高，在800～1000之间。而阳性对照样品中，Rosup 荧光强度值过高，不能检测；1 U-Rosup和5 U-Rosup处理的菌体细胞的荧光强度值明显较阴性对照增高，但两者数值差别不明显。各对照孔测得的具体荧光强度值见表1。

二、不同浓度氯法齐明和吡法齐明刺激H37Rv标准株后的菌体细胞活性氧含量测定

不同浓度氯法齐明和吡法齐明刺激H37Rv标准株后的菌体细胞荧光强度值随着时间延长而不断增高，20 min左右趋于稳定，记录试验数据。结果显示，经不同浓度氯法齐明和吡法齐明刺激后，菌体细胞内积累的活性氧含量(即荧光强度值水平)均明显增加，至少是无药物刺激的阴性对照菌株(H37Rv标准株+DCFH-DA)的2倍。各微孔测得的具体荧光强度值见表2。

在不同浓度氯法齐明处理的菌株中，1倍MIC的氯法齐明处理的菌体细胞荧光强度值最高，2个微孔不同药物浓度处理样本测定的平均荧光强度值排序为1 MIC>8 MIC>2 MIC>4 MIC，各样本药物处理浓度和荧光强度值均值间无统一的变化趋势，未进行相关和回归分析。而在各浓度吡法齐明处理的菌株中，菌株测定的荧光强度值与药物浓度之间存在明显的剂量依赖性，2个微孔不同药物浓度处理样本的荧光强度值均值排序为8 MIC>4 MIC>2 MIC>1 MIC，浓度随荧光强度值的增高而增高，呈现明显的正相关(Spearman相关性分析，r=0.976,P<0.001)。

进一步研究发现，不同浓度吡法齐明处理的菌株测得的荧光强度值随着浓度的加倍，荧光强度值增高的数值基本一致，故对吡法齐明浓度和荧光强度值做线性回归分析。首先以处理用吡法齐明的浓度为X，测得的荧光强度值为Y做散点图，并作线性拟合趋势线，如图1可见各点基本在一条直线上，统计分析求得线性趋势拟合方程为Y=2539.130X+1848.130，判定系数R2=0.979。回归方程检验结果显示F=92.576，P=0.011，回归模型有统计学意义。

图1 吡法齐明处理浓度与荧光强度值的线性回归拟合曲线

三、MTB的过氧化氢酶活性测定

以H37Rv标准株和13385临床分离株作为敏感对照，对8株氯法齐明耐药菌株的过氧化氢酶活性进行测定。结果显示，H37Rv标准株与13385临床分离株的过氧化氢酶活性分别为0.54 U/104cell和0.41 U/104cell，均值为0.48 U/104cell；而8株氯法齐明耐药菌株的过氧化氢酶活性范围在0.68～1.08 U/104cell，均值为0.87 U/104cell(表3)，明显高于13385菌株和H37Rv标准株将近2倍。

表1 阴阳性对照试剂测定的活性氧荧光强度值

注编号1、2为测定的2个平行孔；1 U-Rosup为菌体经1个单位Rosup处理，5 U-Rosup为菌体经5个单位Rosup处理；Overflow为测定值过高

表2 不同浓度氯法齐明和吡法齐明刺激菌体细胞后的活性氧含量测定结果

表3 各菌株过氧化氢酶活性测定结果

注A1：初始吸光度值；A2：药物作用1 min后的吸光度值；ΔA=A1-A2；CAT：过氧化氢酶

对5株吡法齐明敏感菌株(H37Rv标准株、13385临床分离株、8株氯法齐明耐药菌株中3株对吡法齐明敏感)与5株耐药菌株的测定结果显示，吡法齐明敏感菌株的过氧化氢酶活性范围在0.41～0.95 U/104cell，均值为0.71 U/104cell，且过氧化氢酶活性高低不等、范围较广；而吡法齐明耐药菌株的过氧化氢酶活性范围在0.80～1.08 U/104cell，均值为0.88 U/104cell(表3)，均高于吡法齐明敏感菌株，但与氯法齐明耐药菌株均值相近。

讨 论

氯法齐明合成已超过60年时间，在其合成伊始，就因其良好的体外抗结核活性引起了临床的广泛重视，但对其作用机制的研究仅局限于数种假说[7-10]，其中对“氯法齐明通过在菌体内发生氧化还原反应并不断累积活性氧(主要为过氧化氢和过氧化物)而发挥抗菌活性”的假说认可度最高。现有研究认为，氯法齐明主要作用在细菌呼吸链和离子转运蛋白上，如Barry等[6]提出了氯法齐明可能通过活性氧起作用，而Yano等[7]做了进一步阐述，认为氯法齐明是一种前体药物，可以在Ⅱ型NADH醌氧化还原酶(NADH-quinone oxidoreductase type 2, NDH-2)的作用下被NADH还原为活性形式，再和O2自发氧化反应并释放活性氧，当胞内的活性氧浓度积累至1.0 mmol/L左右后即开始发挥杀菌作用。进一步的研究还发现，缺氧环境中培养的细菌更容易产生氯法齐明耐药性，提示氯法齐明抗结核作用的发挥离不开一系列的氧化还原反应[8]。也有研究认为，K+转运体是氯法齐明的主要作用靶点，磷脂酶A2是K+转运体抑制剂，氯法齐明可以通过增加磷脂酶A2的活性和减少K+的吸收来抑制细菌K+转运体和细菌腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)的产生而发挥抗菌作用[9]。另外，也有研究发现氯法齐明可以增加巨噬细胞和单核巨噬细胞胞内半胱天冬酶-3的表达，进一步诱导巨噬细胞凋亡[10]。

本研究通过测定氯法齐明和吡法齐明作用MTB前后菌体细胞内活性氧含量水平，以及对氯法齐明和吡法齐明敏感或耐药的菌株中过氧化氢酶的活性水平，对吡法齐明的作用机制进行初步研究，分析吡法齐明是否具有与氯法齐明相类似的作用机制，即是否通过在MTB胞内积累活性氧来发挥杀菌作用。本研究使用的活性氧检测试剂盒是一种利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测的试剂盒。该试剂盒的应用基于以下原理：DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，在其进入细胞后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH而生成有荧光的DCF。因此检测DCF的荧光强度值就可以知道细胞内活性氧的水平。

在MTB活性氧测定中，本研究发现MTB在经氯法齐明和吡法齐明处理24 h后菌体内均积累了至少2倍原有活性氧含量的水平，提示活性氧在氯法齐明和吡法齐明抑制MTB的过程中起到了重要作用，两药可能有着相似的作用机制；但有研究表明，相对于氯法齐明，吡法齐明对MTB临床敏感株和耐药株的体外实验均表现出更强的抑制作用[3]，在动物模型中也表现出更强的疗效[3, 11]，即服用吡法齐明的小鼠肺组织中的检测菌量仅为服用同样剂量氯法齐明小鼠的1%左右[3]，说明吡法齐明的治疗效果高于氯法齐明；而且，药代动力学研究也进一步表明，当动物体内吡法齐明的血药浓度在3～30 mg/kg 范围时，其血药浓度与生物利用度呈线性动力学过程，且动物性别可明显影响血药浓度达峰时间和峰浓度以及生物利用度[12]。同时，也观察到几个值得注意的现象：一是在各浓度氯法齐明处理的MTB菌株中，经1倍MIC浓度氯法齐明处理的菌体细胞活性氧含量水平最高，而经2倍、4倍和8倍 MIC浓度氯法齐明处理各组菌株的活性氧水平相差不大，且均明显低于1倍MIC浓度氯法齐明处理的活性氧含量水平，可能与1倍MIC浓度的氯法齐明对MTB的抑制效果低于其他处理浓度，保留了较高比例菌体细胞的活性，使24 h的孵育过程中有更多的MTB生长复制并加载了探针，导致1倍MIC浓度氯法齐明处理的菌体细胞活性氧水平明显高于其他处理浓度。而在吡法齐明处理的各菌株中，可能由于实验中以相对较高的浓度(0.04 μg/ml)作为吡法齐明的1倍MIC，导致其药物活性较氯法齐明更强，表现为菌株测定的荧光强度值与药物浓度之间存在明显的剂量依赖性，Spearman相关性分析呈正相关，即各浓度药物处理样本的平均荧光强度值排序为8 MIC>4 MIC>2 MIC>1 MIC，这一结果说明MTB接触的吡法齐明的浓度越高，菌体内积累的活性氧含量水平越高，提示菌体内活性氧的生成与吡法齐明的含量有直接关系，与上述文献一致。二是进一步经线性回归分析显示，吡法齐明处理菌株的荧光强度值与处理用吡法齐明的浓度间呈线性正相关，从另一角度证明了吡法齐明浓度越高荧光强度值越高，这一现象不仅支持了吡法齐明抗菌作用的发挥与菌体内积累的活性氧含量水平有关，同时也提示了菌体内吡法齐明的浓度可以随着菌体外加入的吡法齐明浓度的提高而提高，考虑可能与吡法齐明进入细胞内不会受到菌体细胞壁和细胞膜的阻碍有关，而氯法齐明的给药浓度与测定的荧光强度值并没有表现出正相关的原因很可能与氯法齐明不能完全进入菌体内有关，2倍MIC浓度的氯法齐明即达到了进入菌体细胞的饱和浓度，因而表现出2倍、4倍和8倍氯法齐明处理后测得的荧光强度值相差不大。

过氧化氢酶广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是最主要的过氧化氢清除酶，在活性氧清除系统中具有重要作用。有研究发现，过氧化物酶是各种微生物细胞抵抗活性氧胁迫的最主要方式，特别是芽孢杆菌属的微生物，可以将过氧化氢和超氧阴离子转变成无毒的水[13]。早在1957年，Barry等[6]就提出氯法齐明形成的活性氧中主要为超氧化物和过氧化氢，提示若菌株中过氧化氢酶活性增高，则氯法齐明合成的活性氧的量必然会受到影响。但1992年Van Rensburg等[14]通过对革兰阳性菌的研究发现，菌株是否对氯法齐明耐药与过氧化氢酶状态无关，认为氯法齐明不是通过形成过氧化氢发挥抗菌作用，这与Barry等[6]和Yano等[7]提出的假设是不一致的；但是，需要注意的是该研究仅以不包括MTB在内的另3种革兰阳性菌为研究对象，且具体数据表明这3种革兰阳性菌在从有氧环境换为无氧环境后，其对氯法齐明的MIC均有降低，这一现象应当仅能提示革兰阳性菌在无氧环境下更容易被氯法齐明抑制，而不能认为氯法齐明的耐药表型与过氧化氢酶状态无关。

在过氧化氢酶检测过程中发现，可纳入的对氯法齐明和(或)吡法齐明耐药的菌株仅8株，且其中有5株对吡法齐明耐药，提示两药的耐药率均很低，且吡法齐明的耐药率低于氯法齐明。另外，测定的8株氯法齐明耐药菌株的过氧化氢酶活性均较13385菌株及H37Rv标准株更高，提示氯法齐明耐药菌株对过氧化氢的分解作用更强，导致氯法齐明作用后的菌体内过氧化氢含量和活性氧总水平相对更低；同时也从代谢产物的角度上支持了氯法齐明是通过合成活性氧发挥抗菌活性作用的假说，并以临床标本的检测结果做了验证，而这一假说此前的研究仅局限于实验室模型菌株；而且，这一假说还可以用来解释前期研究中一些待讨论的现象。Ammerman 等[15]测试了多种浓度氯法齐明的体内外抗菌活性后，发现各种浓度的氯法齐明在第1周内均未表现出明显的抗菌活性，而在第2周则可以观察到氯法齐明的抗菌活性随药物浓度或剂量的增高而增强，但浓度或剂量的提高并未使氯法齐明抗菌活性的出现时间提前，呈现出活性延迟现象，推测可能原因如下：一是，氯法齐明首先需要使富含脂质的细菌细胞壁饱和后才能作用到菌体内；二是，破坏电化学H+梯度的质子动力势，阻碍其合成ATP需要一定的时间；三是，在观察到抗菌活性之前需要消耗菌体内所存储的能量。如果从“氯法齐明需要通过胞内累积活性氧而起作用”这一假说来推测，这一现象可能提示提高氯法齐明的浓度或剂量仅能加快氯法齐明在组织中的累积而不能加快氯法齐明或活性氧在MTB菌胞内的累积。

联合分析吡法齐明的活性氧水平和过氧化氢酶活性测定结果提示，在用吡法齐明处理菌体细胞后，菌体内活性氧水平增高，且测定值与氯法齐明处理后的活性氧水平相近，提示吡法齐明可以通过菌体内活性氧的累积发挥杀菌活性，可能有类似氯法齐明的作用机制。但是，过氧化氢酶活性测定结果显示MTB胞内过氧化氢酶活性与MTB对吡法齐明的耐药表型无关，显示过氧化氢酶活性增高的菌株不一定对吡法齐明耐药，可能提示氯法齐明耐药范围较吡法齐明更广泛，也可能提示吡法齐明的作用和耐药机制与氯法齐明类似但不完全相同；例如，吡法齐明在处理菌体后，若菌体中主要累积的活性氧为超氧化物，则菌体内过氧化氢酶活性增高不会表现为与吡法齐明耐药表型一致。

本研究首次对吡法齐明的作用机制进行了探讨，发现吡法齐明的作用机制可能与氯法齐明一致，即抗菌作用的发挥与菌体内活性氧的累积水平相关。同时，本研究也存在一些不足，一是由于氯法齐明和吡法齐明的耐药率相对较低，本研究仅应用了对氯法齐明和吡法齐明均敏感的13385菌株和H37Rv标准株，以及8株对氯法齐明或吡法齐明耐药的菌株对吡法齐明的抗结核作用机制进行了初步研究，对结论的支持不足，后续还需要选取更多的临床耐药菌株进行实验以进一步验证结果；二是吡法齐明通过在菌体内积累活性氧以实现抗结核作用的具体作用途径尚不清楚，仍需要进一步的研究确证。