野蔷薇根多糖提取工艺研究

帅永鑫，陈凌通，叶春林

(1.杭州珍鑫源食品有限公司，浙江 杭州 311300；2.浙江瓯华化工进出口有限公司，浙江 台州 318000；3.浙江科技学院 生物与化学工程学院浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室，浙江 杭州 310023)

野蔷薇根为蔷薇科植物野蔷薇RosamultifloraThunb的干燥根，最早收载于《名医别录》，具有一定的健脾理气、养血调经、助消化等作用，广泛用于治疗胃功能失调、慢性气管炎、肠炎等多种疾病。野蔷薇根提取物的制剂，经药理和临床试验有明显降血脂的作用[1]。野蔷薇根中含有多种有效成分，如多酚、鞣质、皂苷、多糖等[2，3]。研究表明，多糖具有增强机体免疫功能、抗肿瘤、抗辐射、抗氧化、抗病毒、降血脂、抑菌等作用[4-7]。

本研究以野蔷薇根多糖提取率为指标，在单因素实验的基础上，采用正交实验法优化其提取工艺；采用三氯乙酸法除去多糖中的蛋白质，对野蔷薇根多糖进行了初步纯化；通过红外检测初步分析了野蔷薇根多糖的结构；为野蔷薇根的深加工及增加附加值提供了理论依据，具有一定的理论意义和实用价值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 实验材料 野蔷薇根购于杭州市西湖区药房；葡萄糖、无水乙醇、浓硫酸、苯酚、三氯乙酸、氢氧化钠购于上海国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯。

1.1.2 实验仪器 BS2202S精密天平(SARTORIUS公司)；752紫外可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)；DKS-24型电热恒温水浴锅(杭州蓝天化验仪器厂)；GZX-9070 MBE数显鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司)；DZF-6020MBE真空干燥箱(上海博讯实业有限公司)；TGL-16G-A高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)；VERTEX 70红外光谱仪(德国BRUKER公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 葡萄糖标准曲线的绘制 提取液中的多糖含量测定采用苯酚硫酸法。参考文献[8]，求得吸光度(Y)与多糖质量浓度(Y，mg/mL)的标准曲线为：y=39.809 52x-0.012 86，相关系数R2=0.996 1。再根据标准曲线，算出多糖物质质量浓度。

按回归方程计算，多糖提取率的计算公式：

在这个算式中：C为野蔷薇根提取液多糖的质量浓度，mg/mL；n为提取液稀释倍数；V为提取液体积，mL；W为提取用野蔷薇根的质量，mg。

1.2.2 原料预处理 取野蔷薇根，洗净，60 ℃烘箱干燥至恒重，粉碎过60目筛，收集筛下物，置于圆底烧瓶中，采用无水乙醇，回流2 h，脱去表面脂肪，抽滤，60 ℃鼓风干燥待用。

1.2.3 野蔷薇根多糖提取的单因素实验 提取时间考察：精确称取5份2 g经预处理的野蔷薇根粉于三口烧瓶中，分别加入蒸馏水各50 mL，在80 ℃恒温水浴锅中分别冷凝回流提取30、45、60、75、90 mim，实验结束时加入同温度的蒸馏水至原体积。趁热过滤，冷却后分别取2 mL提取液，置于10 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至10 mL。在490 nm紫外分光光度计下测定吸光度，计算多糖提取率。比较不同提取时间的野蔷薇根多糖提取率，以确定提取时间较优取值。

提取温度考察：精确称取5份2 g经预处理的野蔷薇根粉于三口烧瓶中，分别加入蒸馏水各50 mL，分别在60、70、80、90、100 ℃恒温水浴锅中冷凝回流提取60 min，实验结束时加入同温度的蒸馏水至原体积。趁热过滤，冷却后分别取2 mL提取液，置于10 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至10 mL。在490 nm紫外分光光度计下测定吸光度，计算多糖提取率。比较不同提取温度下，野蔷薇根多糖的提取率，确定提取温度较优取值。

料液比考察：精确称取5份2 g经预处理的野蔷薇根粉于三口烧瓶中，分别加入蒸馏水各40、50、60、70、80 mL，在80 ℃恒温水浴锅中冷凝回流提取60 min，实验结束时加入同温度的蒸馏水至原体积。趁热过滤，冷却后分别取2 mL提取液，置于10 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至10 mL。在490 nm紫外分光光度计下测定吸光度，计算多糖提取率。比较各料液比下野蔷薇根多糖提取率，以确定料液比较优取值。

1.2.4 野蔷薇根多糖提取的正交实验 在单因素实验基础上，采用L9(33)正交实验，对提取时间、提取温度和料液比三因素的条件进行优化，方案设计如表1所示。

表1 正交实验因素与水平

1.2.5 野蔷薇根多糖的初步纯化和红外吸收光谱分析 将按上述“1.2.3”和“1.2.4”项下提取得到的多糖溶液在真空旋转蒸发器中浓缩，在浓缩后的多糖溶液中加入4倍体积的无水乙醇，静置1天，然后经1 000 rpm离心，收集沉淀，得粗多糖。

将粗多糖用去离子水复溶，加入等体积质量分数0.9%的三氯乙酸溶液，振荡30 min，静置70 min。1 000 rpm离心10 min，弃去沉淀，上清液用NaOH溶液中和，将清液在真空旋转蒸发器中浓缩至小体积[9]，加入4倍体积的无水乙醇，放置在4℃冰箱过夜，然后经1 000 rpm离心，收集沉淀，经真空干燥得到野蔷薇根初步精制的多糖。

称取经初步精制的野蔷薇根多糖2 mg，做KBr压片，用FTIR测定多糖在4 000～400 cm-1的吸收峰。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果分析

2.1.1 提取时间对野蔷薇根多糖提取率的影响 提取时间对野蔷薇根多糖提取率的影响见图1。

图1 提取时间对多糖提取率的影响

由图1可见，随着提取时间的延长，多糖提取率增大，当提取时间到达60 min时，多糖提取率达到最大，再继续增加时间，多糖提取率反而下降。其原因可能是提取时间太短，多糖与蛋白质、多酚等结合物不能较好地分离，提取率较低；提取时间过长，部分多糖结构受到破坏，从而降低了提取率。故提取时间选择60 min为0水平，进行正交优化。

2.1.2 提取温度对野蔷薇根多糖提取率的影响 提取温度对野蔷薇根多糖提取率的影响见图2。

图2 提取温度对多糖提取率的影响

由图2可见，多糖提取率随提取温度的升高而显著变化，变化趋势为先增大后减小，当温度在80 ℃时提取率最大。这可能是起始升高温度有利于总多糖的扩散、溶出，故提取率增大，而当温度过高时，可能出现多糖受热分解，或杂质溶解度增大等，导致提取率减小。故提取温度选择80 ℃为0水平，进行正交优化。

2.1.3 料液比对野蔷薇根多糖提取率的影响 料液比对野蔷薇根多糖提取量的影响见图3。

图3 料液比对总多糖提取率的影响

由图3可知，在一定范围内，药材的多糖提取量随料液比的增大而增大，但料液比增大到一定程度后，多糖提取量逐渐趋于饱和。野蔷薇根在料液比为1∶30(g/mL)时多糖提取量达到最大，故料液比选择1∶30为0水平，进行正交优化。

2.2 正交实验及结果分析

实验结果见表2。

表2 正交实验因素水平与结果

由表2中极差R值可知，影响野蔷薇根多糖提取率的因素按影响程度大小排序为：B>A>C，即浸提温度>浸提时间>料液比。

2.3 验证实验

经极差分析可知，当组合为A2B3C3，即浸提时间为60 min，浸提温度为90 ℃，料液比为1∶30时，野蔷薇根多糖得率达到最大。按此工艺条件进行三次平行验证实验，得出最优组合提取条件下的多糖得率为(0.561±0.023)%。

2.4 红外光谱分析结果

红外光谱分析结果见图4。

图4 野蔷薇根多糖的红外吸收光谱

由图4可知：3 430 cm-1附近为-OH 基伸缩振动的宽吸收峰，表明野蔷薇根多糖具有分子间与分子内的氢键。2 924 cm-1为CH3、CH2、CH等的C-H 伸缩振动，此处为糖的特征吸收峰[10]。在1 633 cm-1处的吸收峰为游离的羧酸或羧酸盐(-COO)C=O 的非对称伸缩振动，同时也是糖的水化物样品的吸收峰[11]。1 451 cm-1附近的吸收峰是C-H的变角振动峰，1 031 cm-1、1 079 cm-1是吡喃糖环羟基的变角振动所产生，说明糖环结构中含有吡喃糖环结构。900 cm-1以下的指纹区还存在较多密集而复杂的吸收峰，许多峰难以归属，但可以反映具体化合物结构上的微小差别。

3 结语

本研究采用水提取法从野蔷薇根中提取多糖，考察了提取时间、提取温度和料液比等3个因素对野蔷薇根多糖得率的影响。在单因素实验的基础上，进行了正交实验，得出野蔷薇根多糖提取的最优条件为提取时间60 min，实验温度为90 ℃，水料比为1∶30时，野蔷薇根多糖得率达到最大即(0.561±0.023)%。采用三氯乙酸法除去多糖中的蛋白质，醇沉法分离获得多糖，对野蔷薇根多糖进行了初步纯化。通过红外检测初步分析了野蔷薇根多糖的结构，包括野蔷薇根多糖中各种显著的官能团。利用热水浸提法提取野蔷薇根多糖的方法，实验步骤少，操作简单，经济高效，可为热水法提取野蔷薇根多糖的工业化生产提供理论依据。