经方中黄芩-甘草不同配伍比例对黄芩苷溶出的影响

吕志阳，单 聪，杨雨微，顾雪梅，陈 璟，魏 颖

(南京中医药大学翰林学院，江苏 泰州 225300)

黄芩Radixscutellariae是双子叶植物唇形科黄芩Scutellarbaicalensisgeorgi的干燥根，性寒，味苦，具有清热燥湿、凉血止血、泻火解毒等功效，其主要有效成分为黄芩苷。甘草RadixetRhizomaGlycyrrhuzae为豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch、胀果甘草GlycyrrhizainflataBat或光果甘草GlycyrrhizaglabraL.的干燥根和根茎，味甘，性平，归心、肺、脾、胃经，具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药的功效。

黄芩与甘草是经典药对，黄芩汤、葛根黄芩黄连汤等方剂出自《伤寒杂病论》，其中黄芩-甘草配伍比例是3∶2，其功效是清热止利、和中缓急，用于湿热下注所导致的痢疾，现代中医临床常用来治疗下利热痢等病证。或以此方加减治疗各种感染性疾病，如热泻腹痛、急性肠炎、流行性腹泻、急性菌痢、痢疾及病毒性肝炎等湿热内盛病证。黄芩汤的抗炎解毒作用是黄芩、甘草配伍比例变化所产生的协同结果[1-4]。中药方剂的最大特点就是按照一定的组方配伍规律应用于临床，同样中药由于组方配伍比例不同，其主治和功效都会有所差别，根本原因在于其中药的有效成分配伍比例关系发生了变化[5]，黄芩苷的溶出率，甘草酸的浓度，样液表面张力都会随配伍变化而改变。本实验采用不同浸泡时间回流提取，考察一定比例黄芩-甘草对黄芩苷与甘草酸的溶出率、固含物的影响，同时研究在最佳浸泡时间的实验参数下黄芩-甘草不同配伍比例对黄芩中黄芩苷溶出的影响[6-7]。

1 材料与仪器

1.1 材料

实验用药材饮片黄芩(江苏徐州医药股份有限公司中药饮片厂，批号为20161228)，炙甘草(江苏徐州医药股份有限公司中药饮片厂，批号为20161228)；黄芩苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号为PS0912SB13)；甘草酸铵对照品(中国药品生物制品检定所，批号为1107311-201619)；乙腈、甲醇(美国Fisher公司，色谱纯)；磷酸(国药集团化学试剂有限责任公司，分析纯)；纯净水(娃哈哈牌)；高纯水(自制)。

1.2 仪器

安捷伦1260型高效液相色谱仪(安捷伦中国有限公司)；TGL-18C高速离心机(上海安亭科学仪器厂)；FA1204B万分之一电子天平(上海精密科学有限公司)；CAP225D十万分之一电子天平(德国赛多利斯)；BZF50型真空干燥箱(上海博讯)。

2 方法与结果

2.1 黄芩苷与甘草酸的含量测定

2.1.1 色谱条件 (1)黄芩苷：Merck C18色谱柱(250 mm*4.6 mm，5 μm)；以甲醇-水-磷酸(40∶60∶0.2)为流动相；柱温：25 ℃；检测波长：250 nm；流速：1 mL/min；进样量：10 μL。

(2)甘草酸：MerckC18色谱柱(250 mm*4.6 mm，5 μm)；以乙腈-0.05%磷酸为流动相梯度洗脱，柱温：25 ℃；检测波长：240 nm；流速：1 mL/min；进样量：10 μL。梯度洗脱程序，见表1。

表1 甘草酸的梯度洗脱程序

2.1.2 对照品的制备 (1)黄芩苷对照品溶液的制备：取黄芩苷对照品适量，精密称定5.20 mg，加甲醇定容于25 mL的容量瓶中，超声溶解，当浓度为208 μg/mL，即为黄芩苷对照品溶液。

(2)甘草酸对照品溶液的制备：取甘草酸胺对照品适量，精密称定3.50 mg，加70%乙醇定容于25 mL的容量瓶中，超声溶解，当浓度为137 μg/mL，即为甘草酸对照品溶液。

2.1.3 线性关系考察 精密称量黄芩苷对照品、甘草酸铵对照品分别制成浓度为1.38 mg/mL、2.75 mg/mL、5.50 mg/mL、11.00 mg/mL、22.00 mg/mL的黄芩苷、甘草酸的标准品溶液，过0.45 μm微孔滤膜，滤液在“2.1.1”色谱条件下，进行测定，以对照品质量浓度(mg/mL)对测得的峰面积进行线性回归，绘制标准曲线。结果表明：甘草酸在0.2～1.0 mg/mL浓度范围内，线性关系良好，其回归方程为：y=2 430.7x+4.552(r=0.999 97)。黄芩苷在1.38～22.00 mg/mL浓度范围内，线性关系良好，其回归方程为：y=12 198x+159.58(r=0.999 99)。

2.2 不同浸泡时间对黄芩-甘草回流提取中各成分的影响

2.2.1 供试品的制备 称取黄芩-甘草(3∶2)三份，用8倍量水，回流2次，每次回流1h，单因素考察最佳浸泡时间，分别按0 h、0.5 h、1.0 h浸泡，滤出，合并每次滤液，放置至室温，离心样品溶液，取上清液，备用分别编号为供试品溶液A、B、C。

2.2.2 黄芩苷、甘草酸溶出率及固含物测定 取供试品溶液A、B、C，过0.45 μm微孔滤膜，用高效液相测定(黄芩苷含量测定色谱图，见图1)，并计算提取液中黄芩苷、甘草酸的溶出率；精密称取供试品A、B、C溶液50 mL，置于已经干燥至恒定质量的蒸发皿中，在电炉上蒸干，于105 ℃的烘箱内干燥3.5 h，置于干燥器内，冷却30 min至室温，精密称定质量，并按照取样体积与样品总体积比例折算样品固含物总量。结果见表2。

表2 不同浸泡时间黄芩苷、甘草酸溶出率及固含物结果

图1 黄芩苷对照品(A)、供试品A(B)色谱

结果表明：浸泡0～1 h内，黄芩苷、甘草酸的溶出率、固含物的含量均随着浸泡时间的增加逐渐降低，其中黄芩苷溶出率由97.376 mg/g下降至64.968 mg/g，甘草酸溶出率由3.382 mg/g下降至2.256 mg/g，固含物量由20.96%下降至16.88%，故在以下不同比例配伍实验回流时，药材无需浸泡。

2.3 黄芩-甘草不同配伍比例对黄芩苷的溶出影响

2.3.1 供试品制备 分别按黄芩-甘草配伍比例1∶6、1∶5、1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1称取黄芩-甘草药材饮片，加8倍量水，加热回流2次，每次1 h，合并2次滤液，放置至室温，离心样品溶液，取上清液，备用。

2.3.2 黄芩苷、甘草酸含量测定 取在“2.3.1”项下制备的9组不同配伍比例供试品样液，过0.45 μm微孔滤膜，滤液分别按“2.1.1”项下色谱条件，行高效液相测定，并计算9组样液中甘草酸浓度、黄芩苷的溶出率和相对溶出率。结果见表3。

2.3.3 黄芩与甘草不同配伍比例表面张力测定 取“2.3.1”项下制得的9组供试品溶液采用wilhelmy吊片[8]测定表面张力，采用盖玻片插入液体，使其底面与液面接触，测定吊片脱离液体所需与表面张力抗衡的最大力(F)。结果见表3。

表3 不同配伍比例黄芩苷、甘草酸溶出率及表面张力实验结果

结果表明：在黄芩-甘草配伍比例1∶1～1∶6时，黄芩苷溶出率随着甘草比例的增大可以达到最大值。当黄芩-甘草配伍比例为3∶1时，甘草酸的浓度达0.193 mg/mL，黄芩苷的相对溶出率最大，溶出率为86%，表面张力最小，张力值为50.76 mN/m，故此时的甘草酸浓度是最佳的临界胶束浓度。

3 讨论

本研究结果显示，随着浸泡时间的延长，黄芩苷的溶出率、固含物的量均降低，可能因为自身的酶分解黄芩苷，而导致黄芩苷的溶出率降低，印证了《伤寒论》原文的煎煮方法(没有提及浸泡)。在黄芩-甘草不同配伍比例实验中，合提液中黄芩苷的相对溶出率随着甘草浓度的增加而增大，提示黄芩苷的溶出与甘草酸在溶液中形成胶束有关。

甘草中的甘草酸具有表面活性剂的作用，当黄芩-甘草按不同比例配伍时，溶液的表面张力出现一个拐点，达到最小值50.76mN/m，此时为甘草酸最佳的临界胶束浓度，形成胶束后使难溶性的黄芩苷在水溶液中的溶解度达到最大。通过测定，经典方黄芩汤(黄芩-甘草：3∶2)的相对溶出率略高于(黄芩-甘草：3∶1)的溶出率(86.06%)，由此证明黄芩汤经典药对黄芩-甘草(3∶2)也是有科学依据的，但根据实验结果，临床使用时可以相对降低甘草的使用比例但不应低于3∶1，也可以达到较高的黄芩苷溶出率，并节省中药材。

4 结语

黄芩与甘草作为经典药对普遍应用于临床，但若组方配伍比例不同，导致中药的有效成分配伍比例关系发生了变化，其主治和功效都会有所差别。本实验通过采取不同的浸泡时间、黄芩-甘草的不同配伍比例进行研究，以表面张力、相对溶出率为评价指标，最佳配伍比例为3∶1，此时表面张力最小，黄芩苷相对溶出率最大。