药用昆虫九香虫总RNA提取方法筛选

陈绪美，尹志勇，郑玉琳，檀 军，田 莹，郭建军

(贵州大学 昆虫研究所 贵州山地农业病虫害重点实验室，贵州 贵阳 550025)

传统中药九香虫AspongopuschinensisDallas，1851是昆虫纲Insecta半翅目Hemiptera兜蝽科Dinidoridae昆虫，在贵州、云南、四川、广西、广东、台湾、安徽等地均有该虫分布[1]。九香虫最早记载于《本草纲目》：“九香虫产于贵州永宁赤水河中……主治膈脘滞气，脾肾亏损，壮元阳”[2]，因其具有理气止痛、温中助阳等功能而备受人们的重视[3]。现代医药研究表明，九香虫具有良好的抗癌功效，其可用于治疗食管癌和胃癌等，对乳腺癌、子宫颈癌、喉癌也有一定的疗效[4-6]。

九香虫含丰富的抗癌、抗菌、抗凝血等活性成分[3]，从九香虫中提取高质量RNA是对其药用活性物质相关基因进行深层次研究的重要基础。然而，九香虫属节肢动物，体壁及腹腔中富含大量的几丁质、脂类、蛋白等物质[7]，其对总RNA的提取质量影响较大，进而影响相关功能基因的克隆及表达分析，故筛选高效的总RNA提取方法将有利于九香虫的深层次开发利用。

目前，分离提取总RNA的方法较多，如胍/热酚法[8]、氯化胍法[9]、异硫氰酸胍法[10]、TRIzol法、CTAB 法、SOS-Phenol 法、酶解法等[11]，各生物公司也研发出多种RNA分离提取的试剂盒。但很多RNA提取方法常存在干扰RNA完整性、纯度及浓度的各类酶和色素等物质，直接或间接地影响RNA的提取质量[12]。本研究采用3种RNA分离提取方法：TRIzol法、RNAeasy动物RNA抽提试剂盒法、HP Total RNA Kit试剂盒法进行九香虫总RNA的提取，用1%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测所提取的九香虫总RNA的完整性、浓度、纯度，并对其结果进行分析比较，以期筛选到一种能够获得高质量九香虫RNA的提取方法，为其后续功能基因筛选研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

九香虫采自遵义习水(东经106°22′、北纬22°32′)，液氮速冻，保存于-80 ℃冰箱。焦碳酸二乙酯(DEPC)、75%乙醇、氯仿、异丙醇、2-巯基乙醇、无水乙醇，RNAeasy动物RNA抽提试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)、HP Total RNA Kit试剂盒(OMEGA Bio-tek)。

1.2 RNA提取

1.2.1 TRIzol法 取185 mg九香虫于液氮充分研磨，转移至1.5 mL离心管中，加入600 μL TRIzol，振荡30 s，室温放置5 min；加入160 μL氯仿，振荡15 s，室温放置3 min，4 ℃，10 000 g 离心20 min；取上层无色水相于RNAse-free离心管中，于离心管加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温放置30 min；4 ℃，10 000 g 离心20 min，弃上清；加入600 μL 75%乙醇洗涤沉淀，4 ℃，10 000 g离心3 min，弃上清；室温放置3 min，晾干，加入50 μL DEPC水，-80 ℃保存。

1.2.2 RNAeasy动物RNA抽提试剂盒法 取185 mg九香虫组织，置于液氮中研磨成粉末，立刻加入600 μL裂解液，轻轻吹打10次，室温放置5 min；14 000 g离心2 min，取上清；加入等体积结合液，轻轻颠倒混匀5次，移至纯化柱中，12 000 g离心30 s，弃离心产物；加入600 μL洗涤液Ⅰ，12 000 g离心30 s，弃离心产物；加入600 μL洗涤液Ⅱ，12 000 g离心30 s，弃离心产物；再加入600 μL洗涤液Ⅱ，12 000 g离心30 s，弃离心产物，14 000 g离心2 min，去除残留的液体；将RNA纯化柱置于RNA洗脱管中，加入50 μL洗脱液，室温放置3 min，14 000 g离心30 s；重复洗脱一次，-80 ℃保存。

1.2.3 HP Total RNA Kit试剂盒法 取185 mg九香虫组织于2 mL离心管中，加入500 μL Buffer GTC溶解；在室温条件下，12 000 g离心5 min；转移上清液至gDNA离心柱中，25 ℃，12 000 g离心2 min；加入250 μL无水乙醇，吹打混匀；向套有2 mL收集管的HiBind ® RNA Mini离心柱中加入500 μL样本，25 ℃，10 000 g离心1 min，弃离心产物；加入300 μL RNA Wash BufferⅠ，25 ℃，10 000 g离心1 min，弃离心产物；再加入400 μL RNA Wash BufferⅠ，25 ℃，10 000 g离心1 min，弃离心产物；加入500 μL RNA Wash BufferⅡ，25 ℃，10 000 g离心1 min，弃离心产物；再次向离心柱中加入500 μL RNA Wash BufferⅡ，25 ℃，10 000 g离心1 min，弃离心产物；加入30 μL的DEPC水，静置2 min，10 000 g，离心1 min；重复洗脱一次，-80 ℃保存。

1.3 RNA检测

1.3.1 1%琼脂糖凝胶电泳检测 配制1% 琼脂糖凝胶；取3 μL九香虫RNA和2 μL上样缓冲液混合，上样；1% 琼脂糖凝胶中130 V电压下电泳15或20 min，用Bio-Rad凝胶成像仪拍照。三次重复。

1.3.2 紫外分光光度计检测 取九香虫RNA 1μL，用NanoDrop 2000/2000C分光光度计检测九香虫总RNA 的浓度、OD260/280，并计算九香虫总RNA含量，九香虫总RNA含量=RNA浓度×RNA溶液体积/九香虫组织质量。三次重复。

2 结果与分析

2.1 1%琼脂糖凝胶电泳结果

1%琼脂糖凝胶电泳结果见图1，可见用TRIzol法和HP Total RNA Kit试剂盒法提取出的九香虫总RNA有两条清晰可见的条带，使用TRIzol法提取的九香虫总RNA电泳图中28S条带比18S条带的亮度强，用HP Total RNA Kit试剂盒法提取获得的九香虫总RNA的18S条带比28S条带的亮度强，而使用RNAeasy动物RNA抽提试剂盒法提取的RNA未见到清晰的条带。

注：A：TRIzol法(电泳20 min)；B：RNAeasy动物RNA抽提试剂盒(电泳20 min)；C：HP Total RNA Kit试剂盒(电泳15 min)

图1 三种方式提取九香虫总RNA电泳

2.2 紫外分光光度计检测结果

紫外分光光度计检测结果见表1，九香虫RNA的含量以TRIzol法提取的最高(432.856±54.560 ng/mg)，HP Total RNA Kit试剂盒法提取的次之(40.104±19.386 ng/mg)，RNAeasy动物RNA抽提试剂盒法提取的最低(12.879±1.051 ng/mg)；3种方法提取的九香虫RNA的OD260/280都在1.9～2.1，表明被蛋白质和DNA等其他物质污染较少[13]，其中，TRIzol法提取RNA的OD260/280为1.910±0.180，纯度最高。

表1 3种方法提取九香虫RNA的含量、纯度及耗时

综合1%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测结果可知，用TRIzol法提取获得的九香虫RNA完整性、纯度、浓度均最好。

3 讨论

cDNA文库的构建、基因克隆和RT-PCR等实验均需要高质量的RNA[14]，但RNA极容易降解，提取过程中存在的各种核糖核酸酶及理化因子都可能引起RNA的降解，从而影响后续的cDNA合成、基因克隆或表达分析[15-16]。理想的RNA提取方法应能够在复杂环境条件下从不同的样本中提取到高质量的RNA，本实验的研究对象九香虫属于昆虫纲半翅目兜蝽科昆虫，是《本草纲目》记载的一味传统中药，其体壁及腹腔中富含大量的几丁质、脂类、蛋白等物质[7]，严重影响了RNA的提取质量及相关功能基因克隆。因此，筛选合适的RNA提取方法对后续九香虫功能基因的克隆、表达等研究至关重要。

近年来，研究人员对提取昆虫总RNA的方法不断进行比较和优化，王鹏等[17]在提取荒漠甲虫总RNA时比较了TRIzol、CTAB、热酚法以及BioTeke Kit 和TianGen Kit 试剂盒法，发现TRIzol 法提取的总RNA的效率较另3种方法都高；徐文凯等[18]对TRIzol法优化后对意大利蜜蜂的总RNA进行了提取，得到了质量高、完整性好的RNA；高阳等[19]用改进的硅粒吸附法和TRIzol法提取小型昆虫的总RNA。在众多研究报道中发现，TRIzol法是一种提取昆虫总RNA较常用且效果较好的方法。

本研究中的九香虫样本均在相同条件下处理获得，避免了样本差异对提取结果带来的影响。九香虫组织的研磨在离心管中用去酶小研磨棒研磨，此过程避免了在研磨过程中九香虫组织的损失及各种酶类对九香虫RNA的降解。TRIzol法提取RNA是较常规的一种方法，所用的实验试剂都是实验室里的常规试剂，价格都比较低廉，操作方法也比较简便。除了九香虫组织的研磨及离心没有在生物安全柜里操作外，其余步骤均在生物安全柜中操作，这也是本次实验改进点之一。采用TRIzol法提取九香虫RNA耗时较长(耗时约100 min)，RNAeasy动物RNA抽提试剂盒法和HP Total RNA Kit试剂盒法较简便(耗时约40 min)，前者提取RNA的纯度较高、浓度较低，但二者所提取的RNA完整性、浓度、纯度均较TRIzol法差。

综上所述，3种方法中TRIzol法提取九香虫RNA的完整性、纯度、浓度最好，可为后续九香虫功能基因的克隆及基因表达分析提供实验基础。