桑白皮提取物中桑根酮C、桑根酮D及桑辛素的HPLC含量测定

魏 敏，杜鸿灵，金 玲，施翠英，张舜杰，李秋霞，王金兰，张 旭

(成都中医药大学 药学院，教育部中药材标准化重点实验室，中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，成都中医大养生保健科技有限公司，四川 成都 611137 )

桑白皮为桑科植物桑MorusalbaL.的干燥根皮[1]，始载于《神农本草经》，性寒，味甘，归肺经，具有泻肺平喘、利水消肿之功效，常用于肺热喘咳、水肿胀满尿少、面目肌肤浮肿等[2-4]。诸多文献报道，桑属植物的根皮中主要含黄酮类、香豆素类、芳香苯骈呋喃衍生物、多糖等多种化学成分[5]。其中，黄酮类成分桑根酮C、桑根酮D[3，4]具有降血压、抑菌的作用[6]，而降血压作用尤为明显；桑辛素(又称桑根白皮素)，具有抗肿瘤[7]、抗菌[8]、镇痛[9]、抗HIV[10]的药理作用。由此可见，此3种黄酮类成分均为桑白皮中重要的有效成分，但2015年版《中国药典》(一部)并未收载有关桑白皮中有效成分的含量测定方法。目前，虽有同时对桑白皮中桑根酮C、桑根酮D的HPLC含量测定方法[11]，对桑白皮中桑辛素的HPLC含量测定方法[12]，同时对桑白皮中桑根酮C、桑辛素等的HPLC含量测定方法[13]，但同时定量测定桑白皮中桑根酮C、桑根酮D及桑辛素的方法还未见报道。由于在制备桑白皮提取物的过程中，需对其质量进行控制和评价，为了节约分析时间和分析成本，急需建立一种同时测定三个成分的快速简便和定量方法。因此，本研究将建立同时测定桑白皮提取物中桑根酮C、桑根酮D及桑辛素三种成分的HPLC含量测定方法，为桑白皮提取物的质量控制提供参考依据。

1 实验材料

Agilent 1200高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；DZG-6050型真空干燥箱(上海森信实验仪器有限公司)；Ohaus Discovery DV215CD 型电子天平(奥豪斯公司)； UPS-II-20L型优普系列超纯水器(四川优普超纯科技有限公司)；BUG25-13型超声波清洗器(美国BRANSON公司)。

桑白皮提取物由成都中医药大学养生保健科技有限公司提供，桑根酮C(批号：110831-201705，含量：99.8%)，桑根酮D(批号：110753-201815，含量：99.8%)，桑辛素(批号：110749-201717，含量：99.8%)对照品均购自成都普思生物科技股份有限公司。试验中所用试剂，除乙腈为色谱纯外，其他均为分析纯。3个指标性成分的结构式见图1。

注：M1.桑根酮C；M2.桑根酮D；M3.桑辛素

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为InterSustain AQ-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱；流动相为：乙腈(A)-0.1%醋酸水(B)，梯度洗脱(0 ～ 20 min，45% ～ 70% A；20～26 min，70%～86% A)，波长276 nm；柱温30 ℃；流速1 mL·min-1；进样量10 μL。见表1。对照品以及样品色谱见图2。

表1 流动相梯度洗脱程序

2.2 样品的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取桑辛素对照品适量，加无水乙醇配置成0.105 0 mg/mL的对照品储备液，精密称取桑根酮C、桑根酮D对照品适量，用色谱甲醇配置成0.990 0 mg/mL的桑根酮C、0.114 4 mg/mL的桑根酮D对照品储备液。

2.2.2 供试品溶液的制备 (1)超声时间考察。精密称定0.6 g桑白皮提取物5份，置具塞锥形瓶中，平行称取3份，加入甲醇25 mL，称定重量，分别超声提取20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。稀释后取10 μL注入高效液相色谱仪测定，经观察发现，随提取时间的增加，三个成分含量先增加后降低，当提取时间为30 min时，3个成分提取率最高，因此，最终选择30 min为提取时间。测定结果见图3。

(2)提取溶剂量的考察。精密称定0.6 g桑白皮提取物5份，置具塞锥形瓶中，平行称取3份，分别加入甲醇25 mL、50 mL、75 mL、100 mL、125 mL，称定重量，超声提取30 min，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。稀释后取10 μL注入高效液相色谱仪测定，观察发现当提取溶剂体积为50 mL时，3个成分提取率最高，因此，最终选择50 mL为提取溶剂体积。测定结果见图4。

注：A.对照品；B.样品。1.桑根酮C；2.桑根酮D；3.桑辛素

图3 超声时间的考察

图4 提取溶剂量的考察

(3)供试品溶液的制备方法。综上所述，供试品溶液的制备方法为：精密称定桑白皮0.6 g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇50 mL，超声30 min，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，稀释8倍，过滤，取续滤液，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 分别精密吸取桑根酮C对照品储备液180 μL、桑根酮D对照品储备液780 μL、桑辛素对照品储备液230 μL，置于2 mL的棕色容量瓶中，加甲醇至刻度，得到浓度为0.089 1、0.044 6、0.012 1 mg/mL的混合对照品储备液。将混合对照品储备液按“2.1”项下色谱条件测定，以2.5、5、10、15、20 μL分别进样，以峰面积为纵坐标(Y)，对照品质量为横坐标(X)，绘制3种成分的回归曲线，线性方程和范围见表2。

表2 桑根酮C、桑根酮D、桑辛素线性回归方程

2.3.2 精密度试验 精密吸取同一混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件，连续进样6次，进行高效液相色谱分析，测得桑根酮C、桑根酮D、桑辛素峰面积，计算桑根酮C峰面积的RSD为0.85%、桑根酮D峰面积的RSD为1.13%、桑辛素峰面积的RSD为0.86%，表明仪器精密度良好。

2.3.3 重复性试验 精密称取同一批桑白皮提取物6份，按“2.2.2”项下供试品溶液的制备方法制备样品，按“2.1”项下色谱条件进行分析测定，得桑根酮C、桑根酮D、桑辛素的含量分别为6.64%、3.19%、0.95%，计算出RSD值分别为1.78%、1.35%、3.28%，表明所用方法重复性良好。

2.3.4 稳定性试验 精密称取桑白皮提取物，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，于0、2、4、8、12、24 h在“2.1”项下色谱条件进行HPLC分析，测得桑根酮C、桑根酮D、桑辛素峰面积，计算桑根酮C、桑根酮D、桑辛素峰RSD值分别为0.62%、1.32%、0.60%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.5 加样回收率试验 精密称取已知含量的桑白皮提取物0.3 g，平行称取6份，置具塞锥形瓶中，分别精密加入适量桑根酮C、桑根酮D和桑辛素对照品溶液，按“2.2.2”项下供试品溶液的制备方法制备样品，以“2.1”项下色谱条件进行HPLC分析，并计算被测各成分的回收率及RSD。桑根酮C、桑根酮D、桑辛素的平均加样回收率分别为96.87%、101.02%、101.27%，RSD分别为1.90%、2.48%、1.74%，表明所用方法准确度良好。见表3。

2.3.6 样品测定 由于目前成都中医药大学养生保健科技有限公司生产制备的批次较少，仅从生产企业收集到3批样品。按照上述方法进行测定，结果见表4。

表4 桑白皮提取物中3种成分的测定结果 (%)

3 讨论

本研究综合相关文献报道和待测化合物紫外吸收的特征，最终确定检查波长为276 nm；对比考察了超声和加热回流提取，发现两种提取方式提取效果相似，但超声提取更节约时间，因此选择超声提取方法；对比考察了不同的提取溶剂、提取时间、提取体积，最终建立了HPLC法同时测定桑白皮提取物中桑根酮C、桑根酮D、桑辛素3种有效成分的含量。此方法简单、快速，各组分分离度均良好，方法精密度高、稳定性好。采用此方法对3个批次的桑白皮提取物进行分析，由表4结果可知，成都中医药大学养生保健科技有限公司制备的桑白皮提取物质量较为一致，制备方法稳定可靠。