一测多评法同时测定麻杏石甘口服液中3种成分含量

黄 松，崔明旭*，刘爱玲，栗栖凤，史德胜，孙月川，王一凡，刘桂兰，李守军

(1.瑞普(天津)生物药业有限公司，天津 300300; 2.天津瑞普生物技术股份有限公司，天津 300308)

麻杏石甘汤是汉代医圣张仲景的《伤寒论》中的经典名方[1]，采用中药材麻黄、苦杏仁、石膏和炙甘草经水煎而成，具有辛凉宣肺、清热平喘的功效[2]，现代医学常用于治疗风热感冒、急慢性支气管炎、上呼吸道感染、支气管哮喘等疾病，有广阔的临床应用，因此，麻杏石甘汤的质量控制尤为重要。中药复方汤剂的成分复杂，要对其进行质量测定，需要多种中药对照品，且方法复杂繁琐，成本高昂。王智民等于2006年首次提出了一测多评法(Quantitative Analysis of Multi-components by Single-maker, QAMS)[3-8],该方法是以简单、经济、稳定的有效成分为内参物，建立内参物与其他成分之间的相对校正因子(fk/s),最终通过fk/s计算出其他成分含量的方法。研究旨在建立一种QAMS法测定麻杏石甘口服液中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱和苦杏仁苷3种成分含量的方法，以实现对麻杏石甘口服液多指标成分的质量评价。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Waters e2695高效液相色谱仪(美国沃特世公司)；安捷伦1260高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；ME204电子天平(上海梅特勒公司)；ME55电子天平(上海梅特勒公司)；超声波清洗器(宁波新芝公司)；0.45 μm过滤器(日本岛津公司)。

1.2 材料与试剂 盐酸麻黄碱(批号：171241-201508；含量以99.8%计)、盐酸伪麻黄碱(批号：171237-201510；含量以99.8%计)、苦杏仁苷(批号：110820-201607；含量以90.7%计)对照品均购自中国食品药品检定研究院；麻杏石甘口服液由瑞普(天津)生物药业有限公司生产；乙腈，色谱纯；甲醇，色谱纯；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：COSMOSIL 5C18-MS-Ⅱ柱(4.6 mm L.D.×250 mm，5 μm)；柱温：25 ℃；流速：1 mL/min；检测波长：207 nm；流动相：0.1%(体积分数，下同)H3PO4-乙腈，流动相梯度洗脱方法如表1，色谱图如图1。

表1 梯度洗脱方法Tab 1 Gradient elμtion methord

图1 麻杏石甘口服液HPLC色谱图Fig 1 HPLC chromatograms of the MaxingShigan Oral Medicinal Liquid

2.2 供试品溶液的制备 精确吸取麻杏石甘口服液1 mL，加入1 mL 1.44% H3PO4-甲醇(1∶4)溶液，混匀后，8000 r/min，离心10 min，取上清液经0.45 μm过滤器过滤后，装入进样瓶，待上机。

2.3 混合标准品溶液的制备 准确称量盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷适量，置于棕色容量瓶内，用1.44% H3PO4-甲醇(1∶4)溶液溶解并定容。得到浓度分别为851.62、252.82和846.53 μg/mL的混合标准品溶液，经0.45 μm过滤器过滤后，装入进样瓶，待上机。

2.4 去麻黄阴性对照溶液的制备 按照麻杏石甘口服液的制备方法，去掉麻黄药材，制备出去掉麻黄的麻杏石甘口服液，再按照“2.2”项下方法，制备得到去麻黄阴性对照溶液。

2.5 去苦杏仁阴性对照溶液的制备 按照麻杏石甘口服液的制备方法，去掉苦杏仁药材，制备出去掉苦杏仁的麻杏石甘口服液，再按照“2.2”项下方法，制备得到去苦杏仁阴性对照溶液。

2.6 方法学考察

2.6.1 线性关系考察 将梯度稀释的混合标准品溶液按“2.1”项下的色谱条件进行测定，分别记录峰面积。以标准品浓度(X，μg/mL)为横坐标，特征峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归。结果如表2所示。结果表明，各成分标准品在上述线性范围内呈良好的线性关系。

表2 三个标准品的线性关系Tab 2 Linear relationships of three standard sμbstance

2.6.2 精密度试验 取混合标准品溶液适量，按“2.1”项下的色谱条件连续进样6次，进样量10 μL，记录各成分特征峰面积并计算盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷的峰面积RSD值，结果如下表3所示，盐酸麻黄碱的峰面积RSD值为0.81%，盐酸伪麻黄碱的峰面积RSD值为0.52%，苦杏仁苷的峰面积RSD值为0.68%，这一数据表示仪器精密度良好。

表3 仪器精密度测定结果Tab 3 Instrument precision test results

2.6.3 稳定性试验 按“2.2”项下的方法制备供试品溶液，分别在0,4,8,12,16,24 h进样，进样量为10 μL，按“2.1”项下的色谱条件测定，记录各组分色谱峰峰面积。稳定性考察结果如下表4所示，盐酸麻黄碱的峰面积RSD值为2.53%，盐酸伪麻黄碱的峰面积RSD值为1.24%，苦杏仁苷的峰面积RSD值为1.69%，结果表明供试品溶液在24 h内的稳定性良好。

表4 稳定性考察结果Tab 4 Stability test results

2.6.4 重复性试验 按“2.2”项下的方法制备供试品溶液，连续进样6次，进样量为10 μL，按“2.1”项下的色谱条件测定，记录各组分色谱峰峰面积。重复性考察结果如下表5所示，盐酸麻黄碱的峰面积RSD值为1.21%，盐酸伪麻黄碱的峰面积RSD值为0.74%，苦杏仁苷的峰面积RSD值为1.21%，结果表明供试品溶液在该色谱条件下重复性良好。

表5 重复性考察结果Tab 5 Repeated findings

2.6.5 加样回收率试验 取已知盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱和苦杏仁苷含量的麻杏石甘口服液适量，按“2.2”项下的方法制备供试品溶液，记为A液。

制备含盐酸麻黄碱1267.46 μg/mL、盐酸伪麻黄碱948.1 μg/mL、苦杏仁苷1269.8 μg/mL的混合标准品溶液2 mL，用1.44% H3PO4-甲醇(1∶4)溶液稀释至7.4 mL，记为B液。

分别按照A液1200、1000、800 μL和B液800、1000、1200 μL混合均匀，得到6份加样检测溶液。按“2.1”项下的色谱条件测定，记算各组分的平均回收率和RSD值，其检测结果如下表6所示。根据表内数据，本方法的加样回收率在99%～103%范围内，且RSD值小于2%，表明本试验的供试品处理方法准确可行。

表6 各成分加样回收率试验结果(n=6)Tab 6 Results of recovery tests for variousconstituents (n=6)

2.7 相对校正因子测定

2.7.1 计算方法 取经梯度稀释的混合对照品溶液进样，按公式fk/s=fk/fs=CK×SS/CS×SK计算相对校正因子。其中：CK为内标物浓度；SK为内标物峰面积；CS为组分的浓度；SS为组分的峰面积。以盐酸麻黄碱为内标物，计算盐酸伪麻黄碱和苦杏仁苷的相对校正因子，结果如表7所示，其相对校正因子的RSD值均小于2%，表明该方法具有较好的可行性。

表7 各组分相对校正因子Tab 7 Relative correction factors of varioμs constitμents

2.7.2 重现性考察 使用不同型号的高效液相色谱仪和色谱柱对相对校正因子进行测定，计算平均值，考察其对fk/s的影响，结果如表8所示，其在不同型号的色谱仪和色谱柱下测得的相对校正因子的RSD值小于1%，表明该方法的重现性良好，具有较好的可行性。

表8 不同仪器和色谱柱的相对校正因子Tab 8 Relative correction factors on differentinstruments and columns

2.7.3 色谱峰定位 利用相对保留时间对待测组分进行定位，以盐酸麻黄碱为参照，分别考察盐酸伪麻黄碱和苦杏仁苷在不同高效液相色谱仪和色谱柱的相对保留时间值，试验结果如表9所示，盐酸伪麻黄碱和苦杏仁苷对盐酸麻黄碱的相对保留时间的变化较小，可以用来进行色谱峰的定位。

表9 不同仪器和色谱柱的相对保留时间Tab 9 Relative retention time on differentinstruments and columns

2.7.4 样品含量测定 取麻杏石甘口服液6批，分别按照“2.2”项下方法制备成供试品溶液，编号1～6，并按照“2.1”项下色谱条件分别采用外标法和一测多评法进行测定并计算，结果如表10所示。由表可知，两种方法测得的麻杏石甘口服液中盐酸伪麻黄碱和苦杏仁苷含量的相对误差小于0.3%，没有显著性差异，表明建立的一测多评方法具有较好的可行性。

表10 外标法和一测多评法测定各组分含量结果Tab 10 Content of each component of external standard and quantitative analysis of multi-components bysingle marker(QAMS)

3 讨论与结论

3.1 内标物的选择 盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱和苦杏仁苷是麻杏石甘口服液中起作用的主要成分，均有较高的含量，由于盐酸麻黄碱理化性质稳定，且2015版《中华人民共和国药典》中的咳喘宁口服液质量评价以盐酸麻黄碱计，所以，选择盐酸麻黄碱作为内标物。

3.2 色谱条件的选择 使用可见分光光度计对混合对照品溶液进行全波长扫描，综合考虑盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱和苦杏仁苷的最大光吸收，选择207 nm为检测波长。

供试品采用水、30%甲醇、60%甲醇和 1.44% H3PO4-甲醇(1∶4)溶液按1∶1比例混合均匀进行提取，经离心、过滤后进样，比较发现使用1.44% H3PO4-甲醇(1∶4)溶液进行处理的供试品色谱图的峰型好，分离度高。

流动相参照相关文献采用乙腈-磷酸缓冲液(0.02 mol·L-1磷酸，0.05%三乙胺、3.12 g磷酸二氢钠，pH=3)、乙腈-甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液等按不同体积分数、不同比例进行等度和梯度洗脱，其中，前两种流动相由于所含成分多，导致色谱图中存在较多溶剂峰，且梯度洗脱过程中，基线噪声变化较大；而以乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脱方法得到的基线最为平稳，各组分可以同时测定且分离度较好[9-10],故选择乙腈-0.1%磷酸溶液作为流动相。

3.3 结论

随着化学药物的药物残留和抗药性问题越来越严重，人们对中药的需求越来越大。现有中药的质量评价多以单一药材的单一成分为指标，表征中药的质量[11]。但是，仅凭单一成分无法反映成分复杂的中药制剂的优劣，而多成分质量控制使用传统的外标法检测，又涉及中药标准品紧缺和成本高昂的问题，所以，研究建立了麻杏石甘口服液的一测多评方法，利用内标物与待测成分间的相对校正因子，同时测定多个有效成分的含量，为麻杏石甘口服液的多指标质量控制提供了参考[12]。本文的不足之处在于未能检测更多来源于不同厂家的麻杏石甘口服液，对不同厂家产品的相对校正因子进行考察，因此，要明确本文中一测多评法的普遍适用性，还需要对更多不同厂家和批次的麻杏石甘口服液做进一步的研究。