鸡血浆中磺胺氯吡嗪钠和甲氧苄啶含量HPLC检测方法的建立

卓国荣，聂 巧，王东亮，陈鸿雨，秦 琪，卜仕金,3*，张明珠，杨海峰，孙晨明

(1.扬州大学兽医学院，江苏扬州 225009； 2.江苏农牧科技职业学院，江苏泰州 225300; 3.江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州 225009)

磺胺氯吡嗪钠(SPZ)属于磺胺类抗菌药，常用于鸡球虫病的治疗[1-2]，也用于球虫病爆发时继发的细菌病(禽伤寒、禽霍乱)防治[3]；甲氧苄啶(TMP)是目前国内常用的磺胺抗菌增效剂，属于二氨基嘧啶类化学合成抗菌药，与磺胺类药物合用可使磺胺类药物抗菌抗菌活性大大增强[4]，从而可以解决目前临床中磺胺氯吡嗪钠单方应用时逐渐增加的耐药性问题。本试验建立鸡血浆中磺胺氯吡嗪-甲氧苄啶含量测定的HPLC法，对开展磺胺氯吡嗪钠-甲氧苄啶可溶性粉在鸡体内的药动学和生物利用度研究奠定基础。

1 材料

1.1 对照品 磺胺氯吡嗪钠(分子式C10H8N4O2ClNaS·H2O)对照品：含量为99.0%(以磺胺氯吡嗪钠计)，0.1 g/棕色丝口玻璃瓶，批号40908，购自德国Dr. Ehrenstorfer公司。使用前无需干燥处理。甲氧苄啶(分子式C14H18N4O3)对照品：含量为99.9%(以甲氧苄啶计)，100 mg/安剖瓶，批号100031-201405，购自中国食品药品检定研究院。使用前无需干燥处理。

1.2 试剂 甲醇、乙腈为色谱纯，购自美国TEDIA公司。磷酸二氢钾为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.3 试液的配制

1.3.1 0.02 mol/L磷酸二氢钾水溶液 准确称取2.7218 g磷酸二氢钾，用1000 mL超纯水定容并混匀，即制得0.02 mol/L磷酸二氢钾水溶液。

1.3.2 20%甲醇溶液 将甲醇和超纯水按20∶80(V/V)比例混匀，经0.45 μm有机滤膜过滤，超声脱气20 min即可。现配现用。

1.3.3 磺胺氯吡嗪储备液 精密称取磺胺氯吡嗪钠对照品约28.9 mg于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，即配成浓度为1000 μg/mL的磺胺氯吡嗪标准储备液。置-20 ℃冷冻保存。

1.3.4 甲氧苄啶储备液 精密称取甲氧苄啶对照品约25.0 mg于25 mL量瓶中，用乙腈溶解定容并超声助溶，即配成浓度为1000 μg/mL的甲氧苄啶标准储备液。置-20 ℃冷冻保存。

1.3.5 混合标准工作液 分别准确吸取适量磺胺氯吡嗪储备液和甲氧苄啶标准储备液，用20%甲醇溶液稀释使磺胺氯吡嗪和甲氧苄啶的浓度分别为1、5、20、50、100、200、700 μg/mL和0.5、1.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 μg/mL。现配现用。

1.4 血浆样品制备 试验采用黄羽肉鸡，购自中国农业科学院家禽研究所，出壳后饲养在严格消毒的鸡笼内，至35日龄时从翅下静脉采血，血样置于肝素浸润并烘干的离心管内，3500 r/min，离心10 min，-20 ℃冷冻备用。

1.5 仪器及设备 高效液相色谱仪，Agilent 1260型高效液相色谱仪，配有紫外检测器和色谱工作站，Agilent公司；色谱柱，Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(250×4.6 mm，5 μm)，Agilent公司；UPH-11-20T型优普超纯水制造系统，成都超纯科技有限公司；N-EVAPTM112型干浴氮吹仪，美国Organomation公司；电子分析水平，感量0.0001 g，德国塞多利斯天平公司；PB-10型PH计，德国塞多利斯天平公司；KS-250D超声仪，宁波科生仪器厂；WH-1微型漩涡混合仪，上海沪西分析仪器厂有限公司；5810-R型高速冷冻离心机，德国eppendorf股份公司；可调微量移液器，10～100、20～200、100～1000 μL，德国eppendorf股份公司；10 mL指形管，扬子化工玻璃仪器有限公司；1.5 mL指形管，美国Axygen公司。

2 方法

2.1 血浆样品前处理 准确吸取室温下解冻后的血浆样品200 μL置于1.5 mL指形管中，加入1 mL乙腈涡旋振荡3 min后，离心10 min(4 ℃，14000 r/min)，将上清液移至10 mL指形管中。残渣加1 mL乙腈涡旋振荡3 min，离心10 min(4 ℃，14000 r/min)，合并上清液。取上清液于40 ℃干浴氮气吹干后，加入20%甲醇溶液200 μL溶解，涡旋振荡3 min。将复溶后的溶液移至1.5 mL指形管内，离心10 min(4 ℃，14000 r/min)，取上清液经0.22 μm有机滤膜过滤，滤液供HPLC分析。

2.2 色谱条件 色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(250×4.6 mm，5 μm)；流动相： A相，甲醇；B相，0.02 mol/L磷酸二氢钾水溶液(表1)；流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：20 μL； 紫外检测波长：0 ～ 13.5 min，λ1=240 nm(甲氧苄啶)；13.5 ～ 21 min，λ2=268 nm(磺胺氯吡嗪)。

2.3 标准曲线和线性范围 分别准确吸取180 μL室温解冻的空白血浆于7支1.5 mL指形管中，并依次分别加入对应浓度的磺胺氯吡嗪和甲氧苄啶混合标准工作液20 μL，涡旋30 s混匀，使磺胺氯吡嗪和甲氧苄啶的浓度分别为0.1、0.5、2、5、10、20、70 μg/mL和0.05、0.10、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00 μg/mL。即制得以上系列磺胺氯吡嗪、甲氧苄啶空白血浆添加浓度。将上述样品按照2.1项下的血浆样品处理方法处理后，进行HPLC分析。外标法定量，以磺胺氯吡嗪(As)和甲氧苄啶(As)对各自的血药浓度(C)分别进行线性回归，得回归方程。共作3次平行试验。

表1 流动相梯度洗脱条件Tab 1 Gradient elution conditions of mobile phase

2.4 定量限(LOQ)和检测限(LOD) 分别将含磺胺氯吡嗪和甲氧苄啶0.5、1.0、5.0 μg/mL和0.25、0.50、1.00 μg/mL混合标准工作液20 μL加入180 μL空白血浆中，涡旋混匀后制得血浆样品中分别含磺胺氯吡嗪和甲氧苄啶的浓度为0.05、0.10、0.50 μg/mL和0.025、0.050、0.100 μg/mL，每个浓度制备5个平行样品。依据2.1项下的血浆样品处理方法处理，上清液供HPLC分析，测得各样品的峰高与噪音(基线峰高)。取信噪比S/N≥3时浓度为检测限(LOD)；取信噪比S/N≥10，且结合精密度和准确度试验结果确定定量限(LOQ)。

2.5 回收率 取1.5 mL指形管数支，按照2.3项标准曲线制备方法制备分别含磺胺氯吡嗪和甲氧苄啶0.1、2.0、70.0 μg/mL和0.05、0.50、5.00 μg/mL三个浓度的空白血浆添加样品及一条随行标准曲线，每个浓度制备5个平行样品。按2.1项下的血浆样品预处理方法处理后，取上清液20 μL作HPLC分析。分别将测得磺胺氯吡嗪和甲氧苄啶的峰面积(As)，代入当天的各自的标准曲线求得实测浓度。实测浓度与添加浓度之比值乘以百分数即为相对回收率。

2.6 精密度 取1.5 mL指形管数支，按照2.3项标准曲线制备方法制备分别含磺胺氯吡嗪和甲氧苄啶0.1、2.0、70.0 μg/mL和0.05、0.50、5.00 μg/mL三个浓度的空白血浆添加样品及一条随行标准曲线，每批每个浓度制备5份平行样品，连续3 d，共作三个批次。按2.1项下血浆样品处理方法操作。分别将测得磺胺氯吡嗪和甲氧苄啶的峰面积(As)，代入当天的各自的标准曲线得到实测浓度，据此分别计算批内和批间变异系数。

2.7 稳定性

2.7.1 储备液的稳定性 按1.3.5项混合标准工作液制备方法，制备含磺胺氯吡嗪和甲氧苄啶分别为0.1、2.0、20.0 μg/mL和0.05、0.50、5.00 μg/mL的三个浓度混合标准工作液，每个浓度制备5个平行。制备后立刻对样品进行分析，得到第0时数据。之后将两种储备液分别于冻存(约-20 ℃)30、60、90 d后按上述方法配制并进行样品分析。通过与0时测定的数据比较考察储备液贮存期间的稳定性。

2.7.2 样品室温放置下的稳定性 按照2.3项下标准曲线制备方法制备分别含磺胺氯吡嗪和甲氧苄啶0.1、2.0、20.0 μg/mL和0.05、0.50、5.00 μg/mL三个浓度的空白血浆添加样品，每个浓度制备5个平行样品。按2.1项下的血浆样品预处理方法处理后，立刻取上清液20 μL作HPLC分析，得到第0时数据；之后在室温(约22 ℃)下分别放置2、6、8 h后进行样品分析。通过与0时测定的数据比较，考察样品室温放置时磺胺氯吡嗪和甲氧苄啶的稳定性。

2.7.3 样品反复冻融下的稳定性 按照2.3项下标准曲线制备方法制备分别含磺胺氯吡嗪和甲氧苄啶0.1、2.0、20.0 μg/mL和0.05、0.50、5.00 μg/mL三个浓度的空白血浆添加样品，每个浓度制备5个平行样品。按2.1项下的血浆样品预处理方法处理后，立刻取上清液20 μL作HPLC分析，得到第0时数据；在-20 ℃下至少储存一天后取出解冻，之后再次冷冻、解冻，反复共进行3次冻融循环处理。两次冻融间隔时间至少为5 h。通过与0时测定的数据比较，考察反复冻融下样品中磺胺氯吡嗪和甲氧苄啶的稳定性。

2.7.4 样品冻存期间的稳定性 按照2.3项下标准曲线制备方法制备分别含磺胺氯吡嗪和甲氧苄啶0.1、2.0、20.0 μg/mL和0.05、0.50、5.00 μg/mL三个浓度的空白血浆添加样品，每个浓度制备5个平行样品。按2.1项下的血浆样品预处理方法处理后，立刻取上清液20 μL作HPLC分析，得到第0时数据；之后分别于冻存(约-20 ℃)10、20、40 d后进行样品分析。通过与0时测定的数据比较，考察样品贮存期间的稳定性。

2.8 干扰性

2.8.1 混合标准工作液的干扰性 按1.3.5项下混合标准工作液制备方法，制备2 mL含磺胺氯吡嗪和甲氧苄啶分别为0.1、2.0、20.0 μg/mL和0.05、0.50、5.00 μg/mL的三个浓度混合标准工作液；准确吸取适量磺胺氯吡嗪标准储备液，用20%甲醇溶液稀释使磺胺氯吡嗪的浓度分别为0.1、2.0、20.0 μg/mL；准确吸取适量甲氧苄啶标准储备液，用20%甲醇溶液稀释使甲氧苄啶的浓度分别为0.05、0.50、5.00 μg/mL。每个浓度制备5个平行。

上述标准工作液制备后取20 μL于2.2项下色谱条件下作HPLC分析。通过相同浓度的混合标准品与单一磺胺氯吡嗪或甲氧苄啶标准品测定的数据比较，考察混合标准工作液中同时存在磺胺氯吡嗪和甲氧苄啶时，对彼此测定结果的干扰性影响。

2.8.2 空白血浆添加样品的干扰性 按照2.3项下标准曲线制备方法制备分别含磺胺氯吡嗪和甲氧苄啶0.1、2.0、20.0 μg/mL和0.05、0.50、5.00 μg/mL三个浓度的空白血浆添加磺胺氯吡嗪-甲氧苄啶样品；取20 μL经20%甲醇溶液稀释至1、2、20 μg/mL浓度的磺胺氯吡嗪标准工作液，添加至180 μL空白血浆中，制备0.1、2.0、20.0 μg/mL三个浓度的空白血浆添加磺胺氯吡嗪样品；取20 μL经20%甲醇溶液稀释至0.5、5.0、50.0 μg/mL浓度的甲氧苄啶标准工作液，添加至180 μL空白血浆中，制备0.05、0.50、5.00 μg/mL三个浓度的空白血浆添加甲氧苄啶样品。每个浓度制备5个平行样品。

将上述样品按2.1项下的血浆样品预处理方法处理后，取上清液20 μL于2.2项下色谱条件下作HPLC分析。通过血浆添加相同浓度的混合标准品与单一磺胺氯吡嗪或甲氧苄啶测定的数据比较，考察样品中同时存在磺胺氯吡嗪和甲氧苄啶时对彼此测定结果的干扰性影响。

3 结果与分析

3.1 磺胺氯吡嗪和甲氧苄啶血浆样品测定的色谱图 磺胺氯吡嗪标准品和甲氧苄啶混合标准品、空白血浆及空白血浆添加甲氧苄啶混合标准品色谱分析图分别见图1～图5。在本试验建立的色谱条件下，磺胺氯吡嗪出峰时间在14.9 min左右，甲氧苄啶出峰时间在9.1 min左右，且待测组分与溶剂峰及血浆中其他基质组分能完全分开。

图1 磺胺氯吡嗪(0.05 μg/mL)和甲氧苄啶(0.025 μg/mL)混合标准品色谱图Fig 1 Chromatogram of Standard Mixtures of SPZ (0.05 μg/mL) and TMP (0.025 μg/mL)

图2 空白血浆色谱图Fig.2 Chromatogram of blank plasma

图3 空白血浆添加磺胺氯吡嗪(0.05 μg/mL)和甲氧苄啶(0.025 μg/mL)样品色谱图Fig 3 Chromatogram of blank plasma added with SPZ (0.05 μg/mL) and TMP (0.025 μg/mL)

图4 磺胺氯吡嗪(0.1 μg/mL)和甲氧苄啶(0.05 μg/mL)混合标准品色谱图Fig 4 Chromatogram of Standard Mixtures of SPZ(0.1 μg/mL)and TMP (0.05 μg/mL)

图5 空白血浆添加磺胺氯吡嗪(0.1 μg/mL)和甲氧苄啶(0.05 μg/mL)样品色谱图Fig 5 Chromatogram of blank Plasma added with SPZ(0.1 μg/mL) and TMP (0.05 μg/mL)

3.2 标准曲线及线性范围

3.2.1 磺胺氯吡嗪标准曲线及线性范围 磺胺氯吡嗪的血浆药物浓度在0.1～70.00 μg/mL范围内，血浆药物浓度与峰面积比值呈良好的线性关系(R2=1.0000)。结果见表2。以血药浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制的标准曲线见图6。

表2 磺胺氯吡嗪标准曲线回归方程及相关系数Tab 2 Linear regression equation and correlationcoefficient of SPZ

图6 磺胺氯吡嗪标准曲线图Fig 6 Standard working curve of SPZ

3.2.2 甲氧苄啶标准曲线及线性范围 甲氧苄啶的血浆药物浓度在0.05～5.00 μg/mL范围内，血浆药物浓度与峰面积比值呈良好的线性关系(R2=0.9999)。结果见表3。以血药浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制的标准曲线见图7。

表3 甲氧苄啶标准曲线回归方程及相关系数Tab 3 Linear regression equation and correlationcoefficient of TMP

图7 甲氧苄啶标准曲线图Fig 7 Standard working curve of TMP

3.3 检测限和定量限 取信噪比S/N≥3时的浓度为最低检测限，信噪比S/N≥10时的浓度为定量限。根据检测得，该方法磺胺氯吡嗪的检测限为0.05 μg/mL，定量限为0.1 μg/mL；甲氧苄啶的检测限为0.025 μg/mL，定量限为0.05 μg/mL。

3.4 回收率 在空白血浆添加样品中磺胺氯吡嗪和甲氧苄啶的回收率测定结果分别见表4和表5。由表4可见，磺胺氯吡嗪空白血浆添加水平在0.1～70.0 μg/mL时，回收率在92%～104%之间；由表5可见，甲氧苄啶空白血浆添加水平在0.05～5.00 μg/mL时，回收率在91%～96%之间。

表4 空白血浆添加磺胺氯吡嗪样品相对回收率(%)(n=5)Tab 4 Relative recoveries of SPZ in blank plasma (%) (n = 5)

表5 空白血浆添加甲氧苄啶样品相对回收率(%)(n=5)Tab 5 Relative recoveries of TMP in blank plasma (%) (n = 5)

3.5 精密度 在空白血浆添加样品中磺胺氯吡嗪和甲氧苄啶的批内和批间精密度测定结果分别见表6和表7。由表6可见，磺胺氯吡嗪空白血浆添加水平在0.1～70.0 μg/mL时，批内和批间变异系数分别小于6.61%和5.18%；由表7可见，甲氧苄啶空白血浆添加水平在0.05～5.00 μg/mL时，批内和批间变异系数分别小于6.89%和6.84%。

3.6 稳定性

3.6.1 储备液存储期间的稳定性 磺胺氯吡嗪和甲氧苄啶储备液稳定性试验结果分别见表8和表9。结果表明，磺胺氯吡嗪和甲氧苄啶储备液于-20 ℃条件下冻存能够保持稳定达90 d。

表6 空白血浆添加磺胺氯吡嗪精密度测定结果Tab 6 Precision determination of SPZ in blank plasma

n.样本数;RSD. 变异系数.

表7 空白血浆添加甲氧苄啶精密度测定结果Tab 7 Precision determination of TMP in blank plasma

表8 磺胺氯吡嗪储备液在-20 ℃贮存条件下的稳定性测定结果(n=20)Tab 8 The stability of SPZ stock solutions stored at -20℃(n=20)

表9 甲氧苄啶储备液在-20 ℃贮存条件下的稳定性测定结果(n=20)Tab 9 The stability of TMP stock solutions stored at -20℃(n=20)

3.6.2 室温放置下的稳定性 室温放置下样品的稳定性测定结果分别见表10和表11。结果表明，鸡血浆样品在室温条件(约22 ℃)下放置时磺胺氯吡嗪和甲氧苄啶均可保持稳定达8 h。

表10 空白血浆添加样品放置室温(+22 ℃)下磺胺氯吡嗪的稳定性测定结果(n=20)Tab 10 The stability of SPZ in blank plasma at room temperature (+22℃) (n=20)

表11 空白血浆添加样品放置室温(+22 ℃)下甲氧苄啶的稳定性测定结果(n=20)Tab 11 The stability of TMP in blank plasma at room temperature (+22℃) (n=20)

3.6.3 反复冻融下的稳定性 血浆样品反复冻融条件下的稳定性测定结果见表12和表13。结果表明，鸡血浆样品经三个循环冻融后其磺胺氯吡嗪和甲氧苄啶仍能保持较好的稳定性。

表12 空白血浆添加样品经三个冻融循环(+22 ℃/-20 ℃)后磺胺氯吡嗪的稳定性测定结果(n=20)Tab 12 The stability of SPZ in blank plasma after three freeze-thaw cycles(+22 ℃/-20 ℃)(n=20)

表13 空白血浆添加样品经三个冻融循环(+22 ℃/-20 ℃)后甲氧苄啶的稳定性测定结果(n=20)Tab 13 The stability of TMP in blank plasma after three freeze-thaw cycles (+22 ℃/-20 ℃)(n=20)

3.6.4 样品存储期间的稳定性 样品存储期间稳定性测定结果见表14和表15。结果表明，血浆样品于-20 ℃条件下冻存时磺胺氯吡嗪和甲氧苄啶能够保持稳定达40 d。

表14 空白血浆添加样品在-20 ℃冻存条件下磺胺氯吡嗪的稳定性测定结果(n=20)Tab 14 The stability of SPZ in blank plasma after storing at -20 ℃(n=20)

表15 空白血浆添加样品在-20 ℃冻存条件下甲氧苄啶的稳定性测定结果(n=20)Tab 15 The stability of TMP in blank plasma after storing at -20℃(n=20)

3.7 干扰性

3.7.1 混合标准工作液的干扰性 混合标准工作液的干扰性试验测定结果见表16。结果表明，磺胺氯吡嗪和甲氧苄啶在2.2项的色谱条件下测定两者之间不会产生相互干扰。

表16 磺胺氯吡嗪标准工作液与甲氧苄啶标准工作液之间的干扰性试验测定结果(n=10)Tab 16 Interference test results between standard working fluid of SPZ and standard working fluid of TMP(n=10)

3.7.2 空白血浆添加样品的干扰性 空白血浆添加磺胺氯吡嗪与甲氧苄啶样品，两者之间的干扰性试验测定结果见表17。结果表明，两者之间的出峰时间及实测浓度均不会产生相互干扰现象。

表17 空白血浆添加磺胺氯吡嗪与甲氧苄啶样品的出峰时间干扰性试验测定结果(n=10)Tab 17 The results of interferential test of peak time of SPZ and TMP in blank plasma (n=10)

4 讨 论

4.1 确定磺胺氯吡嗪的紫外检测波长 分别将0.5、1、2 μg/mL的磺胺氯吡嗪标准工作液20 μL加入180 μL空白血浆中，涡旋混匀后分别制得0.05、0.1、0.2 μg/mL三个磺胺氯吡嗪空白添加血浆浓度。依据2.1项下的血浆样品处理方法处理后，设置DAD为200～400 nm全波长扫描(步进值为2 nm)，按2.2项下的色谱条件进行HPLC光谱分析。每个浓度重复3次，确定磺胺氯吡嗪最大紫外吸收波长和最佳检测波长。

在2.2项建立的色谱条件下，磺胺氯吡嗪最大紫外吸收波长为268 nm，且仅在此检测波长下磺胺氯吡嗪检测限能够达到0.05 μg/mL，故本试验采用268 nm为磺胺氯吡嗪的紫外检测波长。

4.2 确定甲氧苄啶的紫外检测波长 分别将0.25、0.5、1 μg/mL的甲氧苄啶标准工作液20 μL加入180 μL空白血浆中，涡旋混匀后分别制得0.025、0.05、0.1 μg/mL三个甲氧苄啶空白添加血浆浓度。依据2.1项下的血浆样品处理方法处理后，设置DAD为200～400 nm全波长扫描(步进值为2 nm)，按2.2项下的色谱条件进行HPLC光谱分析。每个浓度重复3次，确定甲氧苄啶最大紫外吸收波长和最佳检测波长。在2.2项建立的色谱条件下，甲氧苄啶最大紫外吸收波长为200 nm，但在该条件下经过检测器的其他物质也有很大吸收，综合考虑选择240 nm作为甲氧苄啶的检测波长，且在此检测波长下甲氧苄啶检测限能够达到0.025 μg/mL，故本试验采用240 nm为甲氧苄啶的紫外检测波长。

4.3 血浆中磺胺氯吡嗪和甲氧苄啶的提取方法 研究表明在对血样进行处理时主要使用乙腈[5-7]、乙酸乙酯[8]、无水乙醇[9]、10%高氯酸[10]。在血浆中磺胺氯吡嗪和甲氧苄啶的提取方法研究中，试验先后用1 mL纯甲醇、1 mL乙腈、1mL乙腈-异丙醇(4 ∶1)、1mL乙腈-甲醇(4 ∶1)4种方法萃取药物，发现甲醇提取时杂质干扰严重，其余三种方法两种药物回收率均在80%以上，纯乙腈提取较其他组回收率高且杂质较少。又继续比较了以1 mL乙腈提取一次和提取两次，发现两次提取时两种药物的回收率均较一次提取回收率高且均无杂质干扰药峰，故选择提取方法为用1 mL乙腈提取两次。

4.4 血浆中磺胺氯吡嗪和甲氧苄啶含量的测定方法 在本试验建立的测定磺胺氯吡嗪和甲氧苄啶色谱条件下，以安捷伦1260进行DAD全波长扫描，发现磺胺氯吡嗪在268 nm紫外检测波长处有最大吸收，甲氧苄啶最大紫外吸收波长为200 nm，但在该条件下经过检测器的其他物质也有很大吸收，综合考虑选择240 nm作为甲氧苄啶的检测波长。研究发现当柱温为室温或30 ℃时，杂峰干扰甲氧苄啶药物峰，当温度为35 ℃时，甲氧苄啶药峰与杂峰完全分离。研究表明流动相用甲醇和水时，药物保留时间不稳定，当流动相中加入磷酸二氢钾时药物保留时间稳定，将有机相换成乙腈时基线向下漂移。多次试验发现用流动相溶解氮吹后的残渣会导致磺胺氯吡嗪析出，而更换纯甲醇会导致磺胺氯吡嗪出现前沿峰、甲氧苄啶裂峰，将其更换为甲醇和水的混合溶液时药物峰面积和保留时间稳定。比较甲醇和水体积比分别为80∶20、70∶30、50∶50、30∶70、20∶80对药物检测灵敏度的影响，研究表明甲醇和水的体积比为20∶80时对两种药物的检测灵明度均最高，因此,选用甲醇水(20∶80，V/V)溶解氮吹后的残渣。参考孙晨明[5]的研究，本实验采用梯度洗脱有效改善峰形且缩短两药物出峰时间差，同时采用双波长检测降低甲氧苄啶的检测限和定量限，提高灵敏度。当前色谱条件下，磺胺氯吡嗪出峰时间为14.9 min左右，甲氧苄啶出峰时间为9.1 min左右，待测药物磺胺氯吡嗪和甲氧苄啶均能够在图谱上呈现较好的峰形，与其他杂质峰分离开，并且能够准确定量。

5 结 论

在本试验所建立的HPLC条件下，空白血浆添加磺胺氯吡嗪、甲氧苄啶分别在0.1～70.0 μg/mL和0.05～5.00 μg/mL范围内，药物浓度与检测器响应值之间相关性良好(R2= 0.9999)；回收率分别在92% ～ 103%和91% ～ 96%之间；批内系数分别小于6.62%和5.18%，批间系数分别小于6.89%和6.84%。该方法磺胺氯吡嗪和甲氧苄啶的检测限分别为0.05 μg/mL和0.025 μg/mL，定量限分别为0.1 μg/mL和0.05 μg/mL。

本试验所建立的反相高效液相色谱-紫外检测法，分析成本低，操作便捷，检测迅速，方法的灵敏度、准确性和重现性均能满足磺胺氯吡嗪和甲氧苄啶的单独或同时血药浓度检测需求，能够为进一步的磺胺氯吡嗪和甲氧苄啶药动学研究和生物利用度研究提供依据，从而对临床合理用药和抗球虫药物新制剂的研发提供指导。