棕榈酸在体外通过促进凋亡作用抑制宫颈癌Hela细胞增殖的研究

周瑶瑶 陈凤云 屠文骆

宫颈癌是女性生殖系统最为常见的恶性肿瘤之一，居女性恶性肿瘤死亡的第2位，近年来其发病率呈逐年升高趋势，早期宫颈癌首选手术治疗，疗效较好，但中晚期宫颈癌以放化疗为主，部分患者预后不良[1]，如何提高中晚期宫颈癌患者以及复发宫颈癌患者的疗效是目前妇科肿瘤领域的热点问题。近年来对宫颈癌的研究不断深入，但宫颈癌的具体发病机制仍不明确。因此，目前迫切需要进一步深入探讨宫颈癌的具体发病机制，为宫颈癌尤其是中晚期及复发性宫颈癌的治疗与预后提供新思路。棕榈酸(Palmitateacid，PA)是16碳长链饱和脂肪酸，分子式为C16H32O2。它是棕榈油中饱和脂肪酸的主要成分[2]，占其总脂肪酸含量的44%～52%[3]。它的生物学和药理学活性广泛，研究显示其与代谢综合征、心血管疾病、神经退行性疾病、炎症等具有相关性[4-5]。最近的研究报道其有抗肿瘤作用[6]，主要应用于乳腺癌和结肠癌[7]，但其抗宫颈癌的作用鲜有报道。此外，真核生物体内细胞内衰老、变性需依赖细胞内凋亡途径，从而调节细胞质量和数量，而PA的具体抗肿瘤作用是否与其诱导凋亡相关尚未阐明。本研究在体外采用不同浓度PA处理人宫颈癌HeLa细胞，检测PA对HeLa细胞的增殖抑制和促进凋亡作用，探讨PA对宫颈癌HeLa细胞部分作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料

人类宫颈癌细胞HeLa系购自上海赛百慷生物技术股份有限公司；PA购自成都瑞芬思生物科技有限公司；胎牛血清、高糖DMEM培养基、二甲基亚砜(DMSO)购于美国Sigma公司；CCK-8购于日本同仁公司；膜联蛋白V/碘化丙啶凋亡检测试剂盒购于北京索莱宝公司；Transwell小室购于美国康宁公司；荧光倒置生物显微镜购于德国莱卡公司；Bio-Rad550酶标仪购于美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、处理及分组 HeLa细胞使用含10% FBS的高糖DMEM完全培养基(完培)培养，待细胞长至80%～90%时，用PBS清洗2次，加入0.025%胰酶(含0.02% EDTA)消化。等细胞全部脱壁漂浮后，加入3倍体积的完全培养基中和胰酶，1 000 rpm离心5 min，弃去上清，用完全培养基重悬HeLa细胞，调整细胞浓度为1×105/mL的细胞悬液待用。PA溶于DMSO中，配成100 mg/mL母液保存于4℃冰箱。所有浓度的PA均由母液稀释于高糖DMEM培养基中。HeLa细胞分为对照组(不加药)、PA处理组(分别加入PA 25、50、100 μg/mL处理48 h)。

1.2.2 CCK-8实验检测PA毒性 取细胞悬液按100 μL/孔接种于96孔板中培养。将培养板在37℃，5% CO2条件下的恒温培养箱中预培养24 h后，将HeLa细胞分为对照组、PA处理组。随后向每孔加10 μL CCK-8溶液，移入培养箱中继续避光孵育1 h，取出培养板，用全自动酶标仪在波长450 nm处测定每孔的吸光光度(OD)值，并绘制细胞增殖曲线。每个样品每次含有3个复孔，结果来自3次独立重复的实验。

1.2.3 Transwell迁移侵袭试验 将涂有50 μL基质胶(基质胶/无血清培养基：1/5)的Transwell小室，其孔径为8 μm，放在一个24孔板上。将HeLa细胞(1×105个细胞/mL)用100 μL含有不同浓度PA(25、50、100 μg/mL)的高糖DMEM培养基重悬，置于小室的上部。将600 μL完培加入小室的下部。将细胞在37℃下培养48 h。弃去培养基，用湿棉签刮擦每个Transwell室膜的上部以除去未发生迁移及侵袭的细胞。迁移及侵袭的细胞用4%多聚甲醛固定，并用0.2%结晶紫染色。从6个随机选择的显微镜视野计数平均迁移细胞数。

1.2.4 qRT-PCR检测凋亡相关mRNA的表达 取细胞悬液按1 000 μL/孔接种于12孔板中培养。将培养板在37℃，5% CO2条件下的恒温培养箱中预培养24 h后，将HeLa细胞分为对照组、PA处理组。随后用MiniBEST Universal RNA Extraction Kit试剂盒分别提取各组细胞的总RNA。以紫外分光光度计A280、A260定量测定，使提取总RNA测量结果纯度A280/A260为1.8～2.0，浓度≤500 ng/μL为合格。质量合格的RNA逆转录成cDNA，严格按照试剂盒说明书进行，反应体系为25 μL。反应条件：预变性95℃ 5 min，94℃ 30 s，65℃ 30 s，重复40个循环，熔解曲线分析：温度60～95℃。采用2-ΔΔCT法对数据进行相对定量分析，每个样品每次含有2个复孔，结果来自3次独立重复的实验。具体引物序列见表1。

表1 qRT-PCR所用的引物序列

1.2.5 流式细胞实验检测细胞凋亡 取细胞悬液按2000 μL/孔接种于6孔板中培养。将HeLa细胞分为对照组、PA处理组。随后用冷的PBS洗涤，并以2 000 rpm离心10 min以重悬于Binding buffer中。然后加入5 μL膜联蛋白V-FITC，在黑暗中孵育15 min。在流式分析之前将5 μL碘化丙啶加入管中。最后，使用BD FACSCalibur流式细胞仪进行流式细胞术分析，并通过Flowjo软件进行分析。每个样品每次含有3个复孔，结果来自3次独立重复的实验。

1.2.6 统计学分析 运用SPSS 22.0软件进行数据分析，数据结果用均数±标准差表示，两组计量资料的比较采用t检验，多组计量资料的比较采用单因素方差分析随后用Tukey分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度PA对HeLa细胞活性的影响

将对照组的细胞活性设为1，与对照组比较，25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mLPA组Hela细胞的存活率逐渐降低，分别为(0.806±0.056)、(0.582±0.025)、(0.304±0.085)。不同浓度PA组之间Hela细胞的存活率差异均有统计学意义(F=98.0，P<0.0001；25 μg/mLvs. control，P=0.0084；50 μg/mLvs. 25 μg/mL，P=0.0035；100 μg/mLvs. 50 μg/mL，P=0.0009)(图1)，Hela细胞的存活率随着PA浓度的增加而下降，提示PA对Hela细胞的增殖抑制作用具有药物剂量依赖性。

图1 CCK-8方法检测PA对Hela细胞增殖的影响Figure 1 Cell viability of Hela cells treated with PANote：* P<0.05，when compared with PA at different concentrations.

2.2 PA对HeLa细胞迁移和侵袭能力的影响

用基质胶包被的小室进行迁移和侵袭试验，以研究PA对HeLa细胞迁移和侵袭能力的影响。数据显示，与对照组相比，25 μg/mL PA处理的HeLa细胞其迁移和侵袭能力显著减弱(F=141.3，P<0.0001；25 μg/mLvs. control，P<0.0001)(图2A和2B)，且50 μg/mL PA的抑制效果优于25 μg/mL(P=0.0171)，100 μg/mL PA的抑制效果优于50 μg/mL(P=0.0031)，表明PA抑制Hela细胞的迁移和侵袭能力具有药物浓度依赖性。

图2 Transwell实验观测各组Hela细胞迁移、侵袭情况Figure 2 The abilities of migration and invasion of Hela cells treated with PANote：A.Migration and invasion of Hela cells after PA treatment；B.The results of statistical analysis(*P<0.05).

2.3 PA对Hela细胞凋亡相关基因的影响

采用实时荧光定量PCR技术对对照组和PA处理组的Hela细胞进行凋亡相关基因的检测，可见凋亡保护基因Bcl-2在不同浓度的PA作用下均降低，且不同浓度PA组之间的Bcl-2表达差异均有统计学意义(F=164.5，P<0.0001；25 μg/mLvs. control，P=0.0017；50 μg/mLvs. 25 μg/mL，P=0.0029；100 μg/mLvs. 50 μg/mL，P<0.0001)(图3A)；凋亡促进基因Bax在不同浓度的PA作用下均升高(F=121.5，P<0.0001；25 μg/mLvs. control，P=0.0100；50 μg/mLvs. 25 μg/mL，P=0.0066；100 μg/mLvs. 50 μg/mL，P<0.0001)，且Cleaved-caspase-3在不同浓度PA组之间的表达差异均有统计学意义(F=425.1，P<0.0001；25 μg/mLvs. control，P<0.0001；50 μg/mLvs. 25 μg/mL，P<0.0001；100 μg/mLvs. 50 μg/mL，P<0.0001)(图3B和3C)。表明Hela细胞的凋亡水平随着PA浓度的增加而上升，提示PA对Hela细胞的促凋亡作用具有药物剂量依赖性。

图3 qRT-PCR方法检测HeLa细胞中凋亡相关基因的表达Figure 3 The expression of apoptosis-related gene in Hela cells treated with PANote：A.The expression of bcl-2 gene in PA groups(*P<0.05)；B.The expression of bax gene in PA groups(*P<0.05)；C.The expression of cleaved-caspase-3 gene in PA groups(*P<0.05).

2.4 PA对HeLa细胞凋亡的影响

为了进一步对PA诱导HeLa细胞凋亡进行量化，用Annexin Ⅴ-FITC/PI染色细胞，随后用流式细胞术分析。PA处理组凋亡细胞的数量以剂量依赖性方式增加(F=262.6，P<0.0001；25 μg/mLvs. control，P<0.0001；50 μg/mLvs. 25 μg/mL，P<0.0001；100 μg/mLvs. 50 μg/mL，P=0.0064)(图4A)。凋亡细胞的比例从0.280±0.027(25 μg/mL)增加到0.593±0.043(100 μg/mL)，而未经治疗的对照组仅为0.010±0.007(图4B)。表明PA可以明显增加Hela细胞的凋亡率，且随着PA浓度的增加而上升。

图4 流式细胞学检测HeLa细胞凋亡情况Figure 4 PA induced apoptosis in Hela cellsNote：A.The distribution of Hela cells treated with PA by flow cytometry；B.The results of statistical analysis(*P<0.05).

3 讨论

妇科恶性肿瘤宫颈癌发病率高、恶性程度大，我国每年约有2万余名妇女死于宫颈癌[8]。为改善宫颈癌患者预后，降低放疗、化疗副反应和复发率，科研人员不断的探索研究。PA是16碳长链饱和脂肪酸，是棕榈油中饱和脂肪酸的主要成分[2]，占其总脂肪酸含量的44%～52%[3]，分子式为C16H32O2。它的生物学和药理学活性广泛，研究显示其与代谢综合征、心血管疾病、神经退行性疾病、炎症和肿瘤相关。本研究通过人宫颈癌HeLa细胞为对象，观察PA对宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭能力和凋亡的影响。CCK-8结果表明，不同剂量PA(25、50和100 μg/mL)对宫颈癌HeLa细胞增殖有抑制作用，且该抑制作用呈剂量依赖性。迁移侵袭实验结果表明，随着PA浓度的增加，HeLa细胞的迁移和侵袭能力随之减弱。

细胞凋亡是细胞在基因调控下，为适应外界环境的影响主动程序死亡的过程，与肿瘤的发生发展关系密切，形态学上表现为凋亡细胞变形且体积缩小，贴壁培养细胞会出现变圆、皱缩、脱落，细胞核染色质浓缩、边聚，分割成块状和凋亡小体等[9]。大量的研究表明，药物治疗宫颈癌疾病主要是通过诱导其凋亡[10]，其中线粒体凋亡途径是细胞凋亡最主要的途径之一，通常凋亡信号能引起线粒体的通透性转换孔(PT)开放，导致线粒体跨膜电位下降[11]。随着线粒体膜功能障碍，细胞会募集并激活Caspase-3，进而诱发Caspase家族级联反应，最终导致细胞凋亡[12]。氧化应激、辐射和抗癌剂可诱导内源性信号通路的激活，从而导致Bcl家族表达并干扰线粒体膜电位[13]。在线粒体外膜中，Bcl-2家族蛋白的平衡被认为能够维持线粒体膜电位和线粒体功能[14]。因此，Bcl家族是内在信号传导途径的关键指标，高Bcl2表达可以避免细胞凋亡。然而，Bax可以帮助内在途径的进展。如本研究的实时荧光定量PRC结果所示，在用PA处理后，会显著增加细胞质促凋亡Bax和Cleaved-caspase-3基因表达而降低抗凋亡Bcl-2基因水平，破坏线粒体膜电位，进而促进线粒体驱动的细胞凋亡，表明PA通过调节线粒体凋亡Bcl-2蛋白家族，发挥其诱导细胞凋亡的作用。另外流式细胞结果显示，随着PA浓度的提高，HeLa细胞的凋亡水平显著上升。因此，PA可以通过调节内在信号传导通路诱导宫颈癌细胞凋亡并引起线粒体功能障碍。本研究初步验证了PA对HeLa细胞增殖，迁移、侵袭和凋亡的影响，详细的分子机制尚需进一步探索。