FOXD3在肺癌细胞中的作用

刘四卫 崔 玥 孙元元 胡 晶 张文睿 曹孟儒

肺癌严重威胁着人类的生命和健康，非小细胞肺癌(NSCLC)占所有确诊肺癌的85%，NSCLC患者整体5年生存率低于15%[1]。肿瘤的转移和复发是直接导致肺癌治疗失败和患者死亡的主要原因之一[2]。因此寻找治疗的新靶点，对于肺癌的防治具有重要意义。叉头框蛋白D3(Forkhead box D3，FOXD3)是FOX家族的重要成员之一，叉头框(FOX)蛋白家族是一类具有翼状螺旋结构的转录因子。FOXD3在FOX家族中具有独特的叉头结构域，不仅起着转录抑制因子的作用，也可以作为转录激活因子[3]。

据报道，FOXD3在黑色素瘤、胃癌和神经母细胞瘤中均呈低表达，抑制肿瘤生长和侵袭。然而，与这些发现相反，FOXD3在肾癌和子宫内膜癌中表达上调，表现出致癌作用[4-6]。因此，FOXD3可能在人类肿瘤中表现出表达模式和功能的组织特异性。值得注意的是，FOXD3在肺癌中的表达及其在肺癌发生发展中的调控作用仍有待进一步研究。因此本研究将对FOXD3在肺癌发生发展中的作用机制进行研究，为FOXD3作为肺癌的治疗靶点提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

肺癌细胞A549购自上海中国科学院细胞库；1640培养基和胎牛血清购自Gibco公司；青霉素&链霉素双抗购自上海碧云天公司；FOXD3载体、PCDNA3.1载体、MTT试剂盒、DMSO试剂、Transwell小室购自Costar公司；TRIzol购自Invitrogen公司；cDNA合成试剂盒购自TransGenBiotech公司；Real-time PCR试剂盒、DNA合成引物购自苏州金唯智生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 TCGA(The Cancer Genome Atlas)数据库表达分析 从TCGA数据库中下载肿瘤表达谱数据对FOXD3在肿瘤中的表达情况进行分析。进一步对比数据库中肿瘤组织以及癌旁正常组织中FOXD3的表达水平。

1.2.2 GEPIA(Gene Expression Profiling Interactive Analysis)数据库生存分析 利用GEPIA数据库分析FOXD3的高低表达对肿瘤的总体生存期(Overall survival)的影响。

1.2.3 STRING数据库蛋白质互作网络 在数据库中查找已有证据表明与FOXD3有直接相关性的蛋白质、有文献支持与FOXD3有相关性的蛋白质以及预测可能与FOXD3有相关性的蛋白质。

1.2.4 Gene Ontology功能富集分析 功能富集是通过在线数据库Metascape(http：//metascape.org/)分析，并对富集结果进行超几何检验分析。P<0.05认为具有统计学意义。

1.2.5 细胞培养 用含10%胎牛血清的1640培养基培养肺癌细胞(A549)。其培养基中含1%的青-链霉素双抗。细胞在37℃、含5%CO2的培养箱中培养。细胞培养瓶中细胞长到80%时传代，细胞常规换液。

1.2.6 细胞转染 按照转染试剂比例进行预实验，通过荧光倒置显微镜观察转染效果，确定最佳转染试剂比例，然后正式进行实验。操作方法：选取生长状态良好的细胞，在六孔板中每孔加入30万细胞，转染前观察细胞状态，待培养到细胞融合度达80%后转染，转染FOXD3质粒的A549细胞为实验组(A549 FOXD3)，转染PCDNA3.1质粒的A549细胞为对照组(A549 CTRL)，转染用无血清培养基，以2 μg质粒：10 μL的1X PEI进行转染，8 h后换成含有血清的正常培养基，24 h后通过荧光倒置显微镜观察转染效率。转染效率=视野中绿色荧光细胞数/视野细胞总数×100%。

1.2.7 Real-time PCR实验 检测实验组和对照组FOXD3 mRNA的表达量，具体方法为：收集转染FOXD3质粒的A549实验组细胞和转染PCDNA3.1质粒的A549对照组细胞，然后分别加入1 mLTrizol，震荡混匀，按照提取细胞RNA试剂盒操作说明提取RNA，按照cNDA合成试剂盒操作说明逆转录RNA得到cDNA，按照RT-PCR相关操作说明扩增cDNA。引物为FOXD3，序列为，FOXD3-F：5′-ATGACCTCTCCGGCGGCGG-3′，FOXD3-R：5′CTATTGCGCCGGCCATTTGGCT-3′。内参为TUBULIN，得到CQ值，统计分析实验结果。

1.2.8 MTT细胞增殖实验 用胰酶将转染质粒的实验组细胞和对照组细胞消化，稀释细胞后用细胞计数板计数，得出细胞总数，然后在96孔板中每孔加入1 500个细胞，每组细胞做5个复孔，铺板后4 h待细胞贴壁，然后检测0 h细胞数，以后每隔24 h检测一次细胞数。检测方法为：每孔加入20 μL MTT，培养箱中孵育4 h后，小心吸取孔中液体后加入150 μL DMSO，酶标仪检测细胞在波长为570 nm时的吸光度。细胞增殖实验重复三次以上且趋势稳定。

1.2.9 细胞划痕实验 六孔板中A549细胞分别转染PCDNA3.1和FOXD3质粒后，待细胞数长到90%，用10 μL枪头沿着直尺垂直划线，标记选取位置并拍照，随后细胞培养箱培养24 h后观察细胞迁移情况并拍照，每次拍照前将培养基换成PBS，拍完照换回常规培养基。实验重复三次以上且趋势稳定。

1.2.10 Transwell细胞迁移实验 在24孔板中，分别用无血清培养基将4万个转染PCDNA3.1质粒的A549细胞和转染FOXD3质粒的A549细胞悬浮，然后分别加到Transwell小室的聚碳酸酯膜上，膜上为500 μL细胞悬液，膜下为750 μL有血清的正常培养基。细胞培养箱培养22 h，然后用0.1%结晶紫染色30 min，清水清洗结晶紫，用棉棒将小室内膜擦拭干净。观察细胞迁移情况并拍照。

1.2.11 统计学分析 使用SPSS 20.0统计软件分析所得数据，MTT细胞增殖实验中对每组实验每个复孔进行OD570重复测量取均值，并将实验组和对照组数据标准化，实验组和对照组不同时间点的OD值的比较采用重复测量方差分析。Transwell 细胞迁移实验结果中两组样本的均数比较采用t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 FOXD3在多种肿瘤中的表达情况

通过TCGA数据库比对肿瘤组织与正常组织中FOXD3的转录水平。表达差异结果显示，共有28种癌症有差异表达，其中FOXD3在10种肿瘤中表达上调，在皮肤黑色素瘤(SKCM)的表达具有统计学差异(P<0.05)(图1)，而在18种肿瘤中FOXD3表达下调，表达有统计学差异(P<0.05)的有结肠癌(COAD)、直肠腺癌(READ)、睾丸生殖细胞癌(TGCT)(图2)。

2.2 肿瘤中FOXD3表达情况与患者总生存期关系

利用数据库GEPIA在多种肿瘤中对FOXD3的表达与患者总生存期进行分析，结果显示在肺鳞癌(LUSC)、皮肤黑色素瘤(SKCM)、肾上腺皮质瘤(ACC)以及低分化胶质瘤(LGG)4种肿瘤中FOXD3的差异表达与患者总生存期有关(P<0.05)(图3)。

2.3 FOXD3抑制肺癌细胞生长

前期研究发现FOXD3对肺鳞癌患者预后产生影响，为了验证FOXD3在肺鳞癌发生发展中的作用，随后在96孔板中做MTT细胞增殖实验。实验结果显示从24 h开始出现趋势，72 h差异最显著且具有统计学意义(P<0.05)。转染FOXD3质粒的A549细胞增殖能力弱于转染PCDNA3.1质粒的A549细胞，表明FOXD3能够抑制肺癌细胞的增殖能力(图4)。

图1 FOXD3在肿瘤中表达上调Figure 1 The expression of FOXD3 was upregulated in tumor tissuesNote：T for tumor tissue；N for normal tissue；* P<0.05，when compared with the normal tissues.

图2 FOXD3在肿瘤中表达下调Figure 2 The expression of FOXD3 was downregulated in tumor tissuesNote：T for tumor tissue；N for normal tissue；* P<0.05，when compared with the normal tissues.

图3 FOXD3表达与总生存期之间的关系Figure 3 The relationship between FOXD3 expression and overall survival

2.4 FOXD3抑制肺癌细胞迁移

为了明确FOXD3对肺癌细胞A549迁移能力的影响，在初始划痕区域一致的情况下，分别在培养0 h、24 h后观察实验组和对照组细胞生长情况，实验结果显示转染FOXD3质粒的A549细胞的迁移速度明显慢于转染PCDNA3.1质粒的A549细胞，Transwell结果表明转染FOXD3质粒的A549细胞迁移能力明显弱于转染PCDNA3.1质粒的A549细胞。以上研究结果表明FOXD3抑制肺癌细胞A549迁移能力(图5)。

图4 FOXD3对A549细胞的增殖能力的影响Figure 4 The effect of FOXD3 on proliferation of A549 cellsNote：A.The expression of FOXD3 was examined in over-expressed FOXD3 A549 cells by RT-qPCR.The expression of FOXD3 was increased when compared to the control A549 cells(*** P<0.001)；B.Cell viability was examined in A549 cells by MTT assay.The cell viability of control A549 cells was increased when compared to overexpressed FOXD3 A549 cells(* P<0.05).

图5 FOXD3对A549细胞迁移的影响Figure 5 The effect of FOXD3 on migration of A549 cellsNote：A.Migration ability of different cancer cells was detected by wound healing assay；B.The wound healing ability of A549 FOXD3 was weaker than that of A549 CTRL cells(***P<0.001)；C.The number of migration in the control and experimental groups(100×)；D.The statistical results of transwell assay between A549 CTRL and A549 FOXD3 cells.The migration ability of A549 FOXD3 was decreased when compared to the control A549 cells(** P<0.01).

2.5 FOXD3相互作用蛋白质的预测以及功能富集分析

为了进一步研究FOXD3可能参与的信号通路，我们通过在STRING数据库中对FOXD3参与的调控网络进行预测，分析结果显示以FOXD3为中心参与多种基因的表达调控。例如，FOXD3与SOX2、POU5F1、NANOG等多种蛋白质相互作用，随后并对其进行功能富集分析，结果显示相关蛋白质功能主要在激活细胞增殖有关基因，且具有统计学意义(P<0.001)(图6)。

图6 FOXD3互作蛋白质Figure 6 FOXD3 interacts with other proteins

3 讨论

全国恶性肿瘤发病率及死亡率呈逐年上升趋势，其中肺癌在恶性肿瘤中的死亡率位于首位。由于其预后差，死亡率高，给社会带来了巨大的经济负担[7]。

到目前为止，FOXD3在肿瘤中的研究还不太深入。据报道FOXD3直接与miR-137启动子结合，激活其转录，通过AKT2途径抑制人肝癌细胞的生长和转移[8]；FOXD3缺陷能诱导乳腺癌上皮-间质转化并与乳腺癌淋巴结转移呈正相关[9]；在胃癌中，幽门螺杆菌感染是导致胃癌发生的重要因素，感染幽门螺杆菌会导致FOXD3的高甲基化，使FOXD3表达减少，胃癌发生机会增加，并且FOXD3过表达会使CYFIP2和RARB的转录上调，进而抑制细胞增殖[4]。然而有研究发现FOXD3表达低是胃癌的有利预后因素[10]。此外，FOXD3通过EGFR-Ras-Raf-MEK-ERK信号通路抑制结肠癌细胞增殖[11]。

本研究对FOXD3在多种肿瘤中的表达情况进行了全面总结，发现FOXD3在多种肿瘤中都存在差异性表达；同时也分析了FOXD3对肿瘤患者总生存期的影响，研究结果发现FOXD3的差异表达对肺癌患者的总生存期产生影响。因此我们在肺癌中对FOXD3基因进行深入研究，首先构建FOXD3过表达肺癌细胞系，随后进行了细胞增殖和迁移侵袭相关实验，实验结果显示FOXD3抑制肺癌细胞增殖以及迁移侵袭能力。最后本研究通过在STRTNG数据库中对FOXD3参与的蛋白质相互作用网络进行预测，发现FOXD3与POU5F1、SOX2、NANOG等多种蛋白质存在明确的相互作用。并对这四个基因进行GO功能富集分析。结果显示功能主要富集到细胞增殖上，且有统计学意义。POU5F1是POU转录因子家族成员之一，在胚胎发育和干细胞多能性中起关键作用。该基因在组织中的异常表达与肿瘤发生有关。例如在结肠癌中POU5F1低表达患者在根治性手术切除后无病生存率高，POU5F1被认为是结肠癌患者的预后因素[13]。POU5F1在肺癌中也有相关报道，研究发现肺癌的放射抗性与AKT-Onzin-POU5F1轴相关[14]。SOX2是SRY相关HMG-box(SOX)转录因子家族成员之一，是中枢神经系统中干细胞维持所必需的，同时还参与胚胎发育的调节。研究表明SOX2与多种恶性肿瘤进展有关，例如，SOX2的异位表达逆转了人膀胱癌细胞中ChlA-F对细胞侵袭能力的抑制，ChlA-F处理诱导HuR蛋白表达，并且增加的HuR与USP8 mRNA相互作用，导致USP8 mRNA稳定性和蛋白质表达的升高，升高的USP8随后充当E3连接酶以促进SOX2泛素化和蛋白质降解；而且ChlA-F处理显着增加Ser63和Ser73的c-Jun磷酸化，启动miR-200c转录，增加的miR-200c直接结合SOX2 mRNA的3′-UTR以抑制SOX2蛋白翻译[15]。尼古丁是烟草烟雾的成瘾成分，不能引发肿瘤，但可以促进体外细胞的增殖、迁移和侵袭，促进体内肿瘤的生长和转移。有研究已证实尼古丁可以诱导胚胎干细胞因子SOX2的表达，这是非小细胞肺癌细胞中自我更新和维持干细胞特性必不可少的[16]。此外，在肺癌中，SOX2与CtBP1的相互作用可以促进肺腺癌的生长，迁移和侵袭[17]。

综上所述，通过对FOXD3进行互作蛋白预测将为FOXD3的后续研究指明了方向并提供了理论依据。