CDK4/6抑制剂联合mTOR抑制剂在乳腺癌中的作用机制

刘尔钰 杨 昊 梁国华 赵晏方 赵文辉

雌激素受体阳性(ER+)乳腺癌是最常见的乳腺癌亚型，内分泌治疗是该亚型乳腺癌的主要治疗方法，并且可将复发的相对风险降低约40%[1-2]。但辅助内分泌治疗的中位无进展生存期(PFS)仅为9～12个月，大多数患者会面临病情进展[3-5]。通过对ER+乳腺癌信号传导通路的进一步探索，研究出大量的靶向抗肿瘤药物。通过靶向PI3K-AKT-mTOR和CDK-RB-E2F通路，研究出mTOR抑制剂和CDK4/6抑制剂。mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在控制肿瘤细胞生长、生存、mRNA转录、代谢和自噬的信号转导通路中起着重要作用[6]。而mTOR抑制剂通过破坏mTOR的结构完整性，削弱mTOR与相关调控蛋白的联系，阻断下游与相关激酶的相互作用来发挥抗肿瘤作用[7]。CDK4/6抑制剂可以靶向抑制CDK激酶，抑制E2F转录因子转录，从而抑制肿瘤细胞的增殖[8-10]。大量临床研究结果显示mTOR抑制剂治疗ER+乳腺癌时，患者PFS有所提高[11-13]。CDK4/6抑制剂因联合内分泌治疗的成效，FDA加速批准其进入临床[14]。而近期研究的重点在两药联合的抗肿瘤作用，在前临床阶段取得了不错的成绩，下面简单介绍联合用药的机制。

1 mTOR抑制剂和CDK4/6抑制剂联合对CDK-RB-E2F通路的影响

Vistusertib(AZD2014)是mTORC1和mTORC2底物磷酸化的抑制剂，而everolimus(RAD001)是mTORC1抑制剂，palbociclib(PD-0332991)是靶向CDK4/6抑制剂[15-16]。在小鼠试验中，为了检测vistusertib(AZD2014)联合palbociclib(PD-0332991)在体内的效用，palbociclib(PD-0332991)和vistusertib(AZD2014)在各自的推荐剂量(RDE)下联合使用，在第22天评估疗效时，发现联合用药比单药抑制肿瘤生长的作用更强(palbociclib联合vistusertib：106.4%vs. vistusertib：46.5%vs. palbociclib：7.0%)[13]。但palbociclib(PD-0332991)或vistusertib(AZD2014)单独使用时，无论是最大耐受剂量(MTD)或者RDE，均无法达到完全抑制细胞增殖的作用，而当联合用药时，第5天就可以观察到细胞增殖的完全抑制，证明二者联合存在协同效应[13]。在everolimus(RAD001)联合palbociclib(PD-0332991)使用时也发现类似结果[13]。通过对联合用药时两个信号通路的交互作用进一步的研究发现，vistusertib(AZD2014)可以防止palbociclib治疗时cyclin D1的升高[13]。其次，vistusertib(AZD2014)可以降低视网膜母细胞瘤(Rb)磷酸化，并在联合CDK4/6抑制剂时进一步降低[13]。通过测定RB的磷酸化可以鉴定这一结果，结果是CDK4/6抑制剂和mTORC1/2抑制剂联合时对RB磷酸化的抑制作用大于单独用药[13]。最后，观察到vistusertib(AZD2014)和palbociclib(PD-0332991)均使编码E2F的基因的mRNA下调，并在联合治疗中进一步下调，在用药后6 h和24 h内就可观察到此反应，表明E2F转录直接受抑制，而不是通过细胞周期抑制间接影响基因表达[13]。E2F转录因子家族的功能是复杂的，在静止期或G1早期，一些成员充当转录激活因子，而另一些成员充当转录抑制因子，一些E2F转录因子也被认为是细胞周期后期的转录调控因子[17]。因此，E2F介导的转录调控机制可能是复杂的，涉及多个调控机制。但无论是对mTOR通路或CDK-RB-E2F通路的抑制都会抑制E2F因子的转录和使进入S期所需基因的表达降低。遂当联合两药使用时，可以最大化实现对E2F介导的转录的抑制。也有报道CDK4/6抑制剂可以促进PI3K-AKT-mTOR信号的激活，诱导mTOR和AKT蛋白磷酸化水平的剂量依赖性上调[18-19]。所以mTOR抑制剂和CDK4/6抑制剂联合使用可以进一步抑制CDK-RB-E2F通路活性来控制肿瘤细胞的增殖。

2 mTOR抑制剂和CDK4/6抑制剂联合对细胞周期的影响

虽然这两种药物都诱导了细胞周期阻滞，但palbociclib(PD-0332991)诱导细胞形成“大扁平细胞”的细胞形态并增加β-半乳糖苷酶活性，诱导细胞出现衰老样表型，细胞衰老在肿瘤中的作用是复杂的，并且受到细胞自主和细胞非自主效应的调节[20]。为了进一步确定mTORC1/2抑制剂和CDK4/6抑制剂的联合是否会加重细胞出现衰老样表型，但研究发现vistusertib(AZD2014)并没有诱导细胞的大扁平形态学改变，而是使细胞变小[21-23]。同时研究表明单独使用vistusertib(AZD2014)或palbociclib(PD-0332991)都可以减慢细胞的生长。但相比之下，vistusertib(AZD2014)和palbociclib(PD-0332991)的联合使用会导致细胞的完全性生长停滞，并且至少维持24天[20]。所以最终证实CDK4/6抑制剂在诱导细胞衰老表型中的作用，也证明CDK4/6抑制剂与mTORC1/2抑制剂的联合并不会导致衰老样表型的加重，而是会使细胞进入长时间的停滞状态。

3 mTOR抑制剂和CDK4/6抑制剂联合对雌激素受体与染色质结合的影响

雌激素受体(ER)可以通过多种机制来调控乳腺癌信号通路的传导[17-24]。其中PI3K通路和ER信号通路之间的交叉作用已经被发现[25-27]。Herrera-Abreu和她的同事之前还报道了PI3K抑制剂、fulvestrant、palbociclib(PD-0332991)的三重联合治疗乳腺癌时，可以显著减少肿瘤细胞的增殖和生长[28]。为了研究mTORC1/2抑制剂是否直接影响ER与染色质的结合，用差异分析来检测该结果，结果显示：在23 537个ER结合位点中只有37个ER结合位点受到everolimus(RAD001)的影响，而在vistusertib(AZD2014)治疗中没有检测到受影响的结合位点[13]。该分析表明，mTOR抑制剂不会影响ER与染色质的结合，也不会通过ER下游的机制影响ER介导的生长。但ER信号通路可以激活CCND1(编码cyclinD1的基因)启动子，ER+乳腺癌中cyclinD1呈高水平表达[29-31]。并且有报道指出cyclinD1具有结合并促进ER转录活性的作用[29-31]。所以CDK4/6抑制剂、内分泌药物二者联合治疗ER+乳腺癌时，可以起到协同治疗的效用。并且有研究发现vistusertib(AZD2014)、palbociclib(PD-0332991)和fulvestrant三者联合治疗ER+乳腺癌时，可以观察到生长抑制作用(48天肿瘤生长抑制率为110.2%)，提示三组联合治疗乳腺癌可以起到更强效的作用[13]。

4 mTOR抑制剂和CDK4/6抑制剂联合对CDK4/6耐药细胞的影响

临床试验研发的靶向治疗药物的主要限制是其暂时处于临床试验阶段，是短期内抑制肿瘤的生长，存在早期适应的风险，并可以通过多种机制产生耐药[32-33]。为了进一步了解细胞耐药后原传导通路的变化，将对palbociclib(PD-0332991)耐药的细胞群分成10个组，随机选择其中4个组来评估RB磷酸化和E2F转录水平，并检测CDK是否存在突变。该结果显示，palbociclib(PD-0332991)耐药细胞株保留了不同水平的RB磷酸化和E2F转录活性，并且在耐药株中没有发现CDK4或者CDK6的突变[13]。所以在发生CDK4/6抑制剂耐药时，细胞重新启动CDK-RB-E2F通路。研究进一步表明，当vistusertib(AZD2014)治疗该耐药细胞时，仍然可以抑制RB磷酸化，降低E2F依赖性基因的表达，从而抑制细胞生长[13]。因此，在肿瘤细胞对palbociclib(PD-0332991)产生耐药的情况下，vistusertib(AZD2014)仍能够调节CDK-RB-E2F轴，从而控制细胞增殖。表明mTOR抑制剂对palbociclib(PD-0332991)治疗后复发的患者有益。

5 mTOR抑制剂和CDK4/6抑制剂联合对自噬的影响

CyclinD-CDK4/6复合物可以促进TSC2的磷酸化，从而增加mTORC1的活性(图1)[34]。而在肿瘤细胞中PI3K-AKT-mTOR信号通路的持续活跃会抑制自噬的发生。所以CDK4/6抑制剂可以间接抑制mTOR活性。因此，联合抑制CDK-RB-E2F和PI3K-AKT-mTOR通路节点可以最大限度地抑制mTORC1活性，启动自噬的发生。自噬是回收受损细胞器所必需的。所以当mTORC1受到抑制后，促进自噬体形成。然后，自噬体吞噬细胞质和细胞器并与溶酶体融合，在溶酶体中，细胞成分被降解，细胞被回收。自噬在肿瘤发生过程中是一把双刃剑，既是肿瘤抑制因子，又是肿瘤细胞存活的保护剂[6]。研究发现缺乏自噬过程的小鼠会加速促进肿瘤的生长[34]。自噬缺陷的细胞积累蛋白质聚集物、受损的线粒体和活性氧，这些都认为是使DNA损伤和肿瘤发生的因素[6]。所以联合用药可以促进自噬的发生。

图1 ER+乳腺癌信号传导通路Figure 1 The signal transduction pathways in ER+breast cancer

6 mTOR抑制剂和CDK4/6抑制剂联合对能量代谢的影响

能量代谢异常也是肿瘤的标志[37]。有研究表明[37]，细胞周期相关蛋白直接参与细胞能量代谢的调控。其中CDK-RB-E2F通路参与多种代谢过程，如葡萄糖产生和糖酵解代谢，表明代谢反应与细胞增殖密切相关[38]。有研究表明palbociclib(PD-0332991)能使葡萄糖摄取和消耗降低约15%，与mTOR抑制剂联合使用后，葡萄糖摄取和消耗降低25%。在CDK-RB-E2F通路中，E2F转录因子通过抑制线粒体的有氧氧化来负性调控能量消耗，E2F还通过调节磷酸果糖激酶的表达来促进糖酵解过程[39]。此外，在E2F下游，c-myc转录因子可能通过多种机制影响肿瘤的代谢[39]。所以CDK4/6抑制剂通过抑制CDK-RB-E2F通路，抑制肿瘤细胞的葡萄糖代谢。最近在胶质母细胞瘤细胞的研究中，结果显示palbociclib(PD-0332991)联合everolimus(RAD001)可以抑制糖酵解[40-42]。所以这些结果最终表明palbociclib(PD-0332991)联合mTOR抑制剂通过抑制葡萄糖的代谢来提高palbociclib(PD-0332991)的疗效，这为两药联合抑制肿瘤的生长进一步提供了理论基础。

7 小结与展望

PI3K-AKT-mTOR通路和CDK-RB-E2F通路的激活促进了肿瘤耐药的发生，肿瘤细胞再次增殖失控。当联合mTOR抑制剂和CDK4/6抑制剂靶向治疗ER+乳腺癌时，可以进一步降低RB蛋白的磷酸化，抑制E2F功能，控制细胞增殖，起到抗肿瘤的作用。其次也有研究证实两药联合对比单药可以显示出完全抑制细胞增殖的效用，进一步控制肿瘤的生长。最后通过促进自噬的过程，进一步控制肿瘤的形成。还有多种机制表明同时阻断两个通路可以发挥更大的抗肿瘤作用。因为科学的进步，我们期待更多的临床研究来证明两药联合的临床受益率，同时也期待临床试验研究两药联合的不良反应是否可以耐受，会不会出现不良反应的叠加。随着对药物作用机制更好的理解，这两种药物是否可以治疗其他亚型乳腺癌，或者提出更优化的组合来抑制乳腺癌的进展，从而提高乳腺癌患者的生存和生活质量。