基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术直接鉴定尿路感染病原菌

张才庆，李艳，吴青

尿路感染是临床最常见的感染性疾病之一，也是医院获得性感染的主要病因［1］。如今国内、国外诊断尿路感染的唯一标准仍然为中段尿培养［2］。但是这种方法往往要经过2～5 d才能得出细菌鉴定及药敏结果，不能及时为临床诊断治疗提供病原学依据。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF MS）是近年发展起来的一种新型细菌鉴定技术，不但可以直接快速鉴定单个纯化菌落，而且可用于一些无菌体液样本如脑脊液、血液、胆汁、胸水、腹水的直接鉴定，大大地缩短了鉴定检测时间［3-6］。它以敏感、快速、高效的优点而被广泛应用于临床微生物的鉴定，显著降低了样本检测的周转时间和成本［7-8］，该方法无需进行常规的革兰染色、生化反应等，仅在几分钟之内就可完成鉴定比对，操作简便、快速、高通量、低耗材成本。目前MALDI-TOF MS主要应用于对经培养的单个菌落的鉴定，它能够快速准确地鉴定临床常见细菌和真菌，被认为是最有效率的鉴定方法之一［9］。本研究先通过对菌尿液进行差速离心富集，然后运用MALDITOF MS技术对富集后的菌尿进行快速准确的直接鉴定，有效缩短了检测时间，而且鉴定准确率高，旨在为尿路感染的及时诊断提供一个有效可行的实验室检测手段，同时将不同浓度的常见病原菌倍比稀释研究细菌被鉴定的最低检测限度。

1 材料与方法

1.1 标本来源收集2017年6月至2018年11月武汉大学人民医院住院4 493例疑似泌尿系感染病人送检的清洁中段尿，其中男性1 307例，女性3 186例。病人年龄（59.6±19.1）岁，年龄范围为16～104岁，其中＜30岁者596例，30～＜60岁者1 545例，60～＜90岁者2 279例，≥90岁者73例。本研究经武汉大学人民医院医学伦理委员会批准，病人或者近亲属均签署知情同意书。本次报道遵守《世界医学协会赫尔辛基宣言》［10］所有规则。

1.2 主要设备及其配套试剂MALDI-TOF MS仪及配套主要试剂来自德国布鲁克公司，Phoenix-100全自动细菌快速鉴定（ID）和药物敏感试验（AST）检测仪及配套试剂和上机板条来自美国碧迪公司，麦康凯琼脂培养基和哥伦比亚血琼脂平板来自广州市迪景微生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1尿病原菌直接质谱鉴定法 采用差速离心法富集。取混匀的中段尿液标本1 mL于1.5 mL EP管中，2 000×g离心30 s，取上清，于16 000×g离心5 min后取沉渣并用无菌0.9%氯化钠溶液500µL充分震荡混匀后12 000×g离心5 min，弃上清，再用1 mL去离子水洗涤沉淀，同样转速和时间离心弃上清液。用加样器吸取1µL点靶于96孔靶板上，待室温自然干燥后，加1µL 70%甲酸，混匀室温干燥后再加0.8µL70%甲酸，2次甲酸（为了更好地破坏细胞壁较厚的革兰阳性杆菌或酵母菌）自然干燥后加入1µL基质溶液仔细涂敷在每个样本上（样本晾干后必须在30 min内添加基质），将晾干的MALDI靶板立即放入质谱仪中。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪采集的质谱图使用软件BioTyper和FlexAnalysis进行比对分析，查看每个样本的分类结果报告分值。以得分情况判定：2.300～3.000说明高置信度的种水平鉴定，结果显示绿色；2.00～2.299说明确定的属水平鉴定，可能的种水平鉴定，结果显示绿色；1.700～1.999说明可能的属水平鉴定，结果显示黄色；0.000～1.699说明不可靠的鉴定，结果显示红色。

1.3.2传统尿液标本培养阳性病原菌鉴定法 用无菌10µL定量接种环分别取尿液接种于哥伦比亚血琼脂平板（十字半定量划线）和麦康凯Macc平板（三区划线）上，35℃培养18～48 h，按照作业指导书进行菌落计数，即平板生长菌落数×100为每毫升尿液的菌落数，同时采用Phoenix-100全自动微生物鉴定/药敏仪进行菌落鉴定。根据菌落特点、染色和镜下形态，Phoenix-100仪器对菌落鉴定不出来或者不准确时采用其他手工方法进行鉴定。

1.3.3尿培养阳性病原菌的纯化后MALDI-TOF MS鉴定法 尿培养阳性病原菌纯化后单个菌落进行MALDI-TOF MS鉴定。

收集单一常见病原菌感染尿培养阳性标本进行纯化菌落、倍比稀释重新质谱分析检测最低限度浓度。

1.4 质控菌种和仪器校准株大肠埃希菌ATCC25922，肺炎链球菌ATCC49619，金黄色葡萄球菌ATCC25923，白色念珠菌（ATCC10231），光滑念珠菌（ATCC MYA-2950）均由湖北省临床检验中心提供。化脓链球菌和福氏志贺菌均为质评菌株，分别用来做哥伦比亚血琼脂平板和麦康凯琼脂平板的质控。

2 结果

2.1 尿细菌培养结果2017年6月至2018年11月共收集清洁中段尿培养标本4 493份，尿细菌培养菌落计数≥105cfu/mL的标本有1 093份（24.3%）；其中单一细菌尿路感染的样本775例（70.9%），2种细菌感染的样本183例（16.7%），3种及3种以上细菌感染的样本135例（12.4%）；菌落计数＜105cfu/mL的标本有1125份（25.0%），普通培养无细菌生长的标本有2 275份（50.6%）。

2.2 单一菌尿路感染质谱直接鉴定和菌落培养纯化后质谱鉴定结果的比较4 493例标本中培养纯化后菌落鉴定775例仅含1种菌，而质谱直接鉴定有663份阳性，其阳性鉴定率为85.55%（663/775）；在775个单菌株所致尿路感染样本中，菌株的属、种鉴定符合率分别为85.55%（663/775）和83.10%（644/775），其中557株革兰阴性菌属、种鉴定符合率分别为94.80%（528/557）和94.08%（524/557），159株革兰阳性菌属、种鉴定符合率分别为71.07%（113/159）和64.78%（103/159），59例真菌属、种鉴定符合率分别为37.29%（22/59）和28.81%（17/59）。单一菌尿路感染，经培养纯化菌落鉴定MALDI-TOF MS和Phoenix-100/其他b比较，鉴定结果相符。见表1。

表1 单一菌尿路感染质谱直接鉴定和菌落最终鉴定结果的比较/株

2.3 单一菌株尿路感染样本直接质谱鉴定分值分布单一菌株尿路感染标本直接质谱鉴定中，尿培养阳性细菌经富集后MALDI-TOF MS检测，鉴定分值＞1.700占84.26%（653/775），其中革兰阴性菌占94.80%（528/557），革兰阳性菌64.78%（103/159），真菌占37.29%（22/59）。见表2。

表2 单一菌株尿路感染样本直接质谱鉴定分值分布/株

2.4 两种混合菌感染尿标本的菌种检出情况培养纯化后质谱鉴定优势菌的标本183份中，由尿病原菌直接质谱鉴定出优势菌的有134例，直接质谱鉴定率为73.22%（134/183）。尿病原菌直接质谱鉴定结果见表3。

表3 两种混合菌感染尿标本的菌种检出情况

2.5 尿路感染常见菌倍比稀释后的MALDI-TOF MS评分大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌、屎肠球菌运用此方法进行质谱鉴定得出可靠鉴定结果的最低检测限度分别是1.5×104、1.5×105、1.5×105、1.5×106、1.5×106cfu/mL。见表4。

表4 尿路感染常见菌倍比稀释后的MALDI-TOF MS评分

3 讨论

MALDI-TOF MS技术可用于蛋白质、核酸、多糖等多种生物分子的分子量和结构分析。其基本原理为：在MALDI离子源部分，基质与样本形成共晶体后，从激光中吸收能量使样本解吸，基质与样本间发生电荷转移使得样本分子电离；在TOF MS分析器部分，离子在电场作用下加速飞过飞行管道，飞行时间与离子的质荷比成正比，根据到达检测器的飞行时间可测出质荷比，通过软件处理就能得到病原菌特征性的指纹图谱［11］。将采集到的谱图与系统内置数据库中的所有可用的参考谱图进行比较，从而从种的水平上鉴定细菌。MALDI-TOF MS技术在对经培养分离出的菌落进行菌种鉴定时具有高度的稳定性及准确性，极大缩短了传统菌株鉴定的时间，而且其成本也降低了许多［12-14］。本文中单菌株尿路感染，革兰阴性菌通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术直接鉴定有可靠的鉴定结果，但是与最终鉴定结果不相同的有9株，它们为最终鉴定是弗劳地柠檬酸杆菌3株被鉴定为大肠埃希菌，最终鉴定是产酸克雷伯菌3株被鉴定为肺炎克雷伯菌，最终鉴定为普通变形杆菌2株直接鉴定为奇异变形杆菌了，1株约氏不动杆菌被鉴定为鲍曼不动杆菌了。革兰阳性菌中直接鉴定有结果但与最终鉴定不一致的主要有10株，分别是最终鉴定为溶血葡萄球菌直接被鉴定成了金黄色葡萄球菌2株，最终鉴定为屎肠球菌直接鉴定粪肠球菌5株，最终鉴定为表皮葡萄球菌1株被鉴定成了腐生葡萄球菌，2株无乳链球菌鉴定成了链球菌属。在念珠菌中，光滑念珠菌4株和白色念珠菌1株被鉴定为酵母菌。同时将尿路感染常见病原菌作倍比稀释进行MALDI-TOF MS，我们发现在104cfu/mL革兰阴性菌比革兰阳性菌和真菌的质谱鉴定率高。很明显，不同浓度的细菌计数与MALDI-TOF MS阳性有一定的关系。由此得出，细菌在MALDI-TOF仪器的最低检测浓度与细菌的种类、数量应该有一定的相关性。

MALDI-TOF MS鉴定存在差异，可能受以下4个因素影响：（1）MALDI-TOF MS直接检测的尿液样本经离心处理，菌与蛋白混于沉淀中且分布不均，从而导致质谱信号不好；（2）菌量多少不一，菌量多的峰图信号好，因而检测结果可靠，分值高；而菌量少的峰图信号不好，检测结果不好，准确性不高，至于未检出的则可能是菌量过少，低于检出限，且蛋白等杂质干扰掩盖检测信号［9］；（3）革兰阳性菌较革兰阴性菌的细胞壁厚；（4）菌体本身大小有关不易于杂质分离。WANG等［15］研究发现尿液样本中2种菌以1∶1或者1∶2混合时，MALDI-TOF MS直接检测时能够同时检测到两种细菌，而当两者以1∶9比例混合时，只有优势菌能够被检出。而在本研究中，MALDI-TOF MS直接检测混合菌感染的尿液样本时，同一样本中的多种细菌计数在同一数量级时可互相干扰MALDI-TOF MS峰图导致无法鉴定；当非优势菌数量比优势菌低一个数量级，且非优势菌为表皮葡萄球菌、科氏葡萄球菌、无乳链球菌、棒状杆菌、恶臭假单胞菌等可疑污染菌时，优势菌的MALDI-TOF MS峰图受非优势菌的干扰较少，甚至几乎不受干扰。对于可能为混合感染的尿标本，我们可通过尿培养计数鉴别优势菌落，然后进行直接质谱鉴定或者进一步纯培养后再用MALDI-TOF MS鉴定，得出可靠的鉴定结果。

本研究采用差速离心法富集细菌，利用MALDITOF MS对富集后的菌液进行快速直接鉴定，并与常规培养24～48 h后形成的单个菌落鉴定结果进行比较结果，表明MALDI-TOF MS技术可以直接对原始尿液标本中的细菌进行快速、准确的鉴定，为临床医生提供病原学诊断依据，且其成本较低，可在临床进行推广。应用这种快速方法，可省去耗时的培养过程，临床医生可以提前42 h结合病人症状对病人进行诊断并针对病原菌予以合适的抗菌治疗，提高有效治愈率。MALDI-TOF MS直接检测方法还可克服尿培养结果受前期经验性用药影响的缺陷，帮助临床医生及时更改治疗方案，减少经验性用药，防止耐药菌的产生［9］。虽然MALDI-TOF MS拥有众多的优点，但其也有一定的局限性，譬如数据库数据有限，有些种属无法明确区分；培养环境差异，对实验重复性的影响；仪器昂贵，一次性投入成本高；技术门槛高，需要经过专业培训；检测方法商品化程度低，难以在常规实验室开展等。或许我们可以通过样品前处理的标准化、基质选择的规范化、数据库构建的完善化、开发实用的工具软件，以及与一些实验室常规方法相结合等方法提高检测的准确性和效率［16］。MALDI-TOF MS在微生物的鉴定以及耐药性相关领域中已初露锋芒，随着研究的不断深入和广泛，相信这一革命性的研究技术必将给我们带来巨大的辉煌。