微小RNA-503在急性脑梗死病人血清中的表达及对胰岛素样生长因子1受体信号通路的调控

张珊珊，蒲超，张翼，杨旭，季一飞

急性脑梗死（Acute cerebral infarction，ACI）是一种脑血管疾病：脑部血管出现狭窄甚至堵塞后，血液循环出现障碍，脑部供血、供氧中断，致使组织坏死以及神经损伤。ACI以相应神经功能缺失为临床表现，具有较高的发病率、高致残率和高死亡率，不仅危害病人生命，也加重了家庭和社会的负担［1］。目前，关于ACI研究的热点集中在ACI的预防、降低其致残率和死亡率。

研究表明，ACI病人和动物模型中的血清微小RNA（miRNA）表达谱发生了显著改变，且miRNA被证实可参与作用肿瘤细胞增殖和耐药。其中miRNA-503作为抑癌基因在肿瘤发生发展中起重要作用［2］。胰岛素样生长因子1受体（Insulin-like growth factor 1 receptor，IGF-1R）是一种跨膜受体，属于酪氨酸激酶受体大家族，可被IGF-1和IGF-2等激活，常在结直肠癌、胃癌等肿瘤中过表达，促进肿瘤转化、发展，并抑制癌细胞凋亡［3］。miRNA-503可通过调控IGF-1R的表达进而抑制肝癌细胞增殖，促进凋亡［4］。

脑梗死的发生可能与恶性肿瘤有关，被称为恶性肿瘤相关脑梗死［5］。为研究miRNA-503在ACI病人体内与肿瘤的关系，本文检测了ACI病人血清中miRNA-503的表达水平，并初步分析了其在胶质瘤细胞U87中对于IGF-1R表达及调控PI3K/Akt信号通路的作用。

1 资料和方法

1.1 一般资料选取2017年9月至2019年4月间于南充市中心医院确诊的92例急性脑梗死病人作为观察组，其中男性57例，女性35例；年龄范围为55～72岁，年龄（66.33±2.26）岁；体质量范围为52～61 kg，体质量（56.83±2.87）kg。病人均无其他严重并发症。同时挑选同期间于我院体检健康者92例作为对照组，其中男性55例，女性37例；年龄范围为52～70岁，平均（64.63±2.77）岁；体质量范围为51～63 kg，体质量（57.44±2.96）kg。两组一般资料比较，均差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。所有病人及其家属均知情并签署同意书。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 纳入标准和排除标准纳入标准：所有病人的诊断均符合中国脑梗死中西医结合诊治指南（2017）［6］的相关诊断标准，并经过脑血管造影和CT检查确诊［7］。

排除标准：患有严重原发性疾病者，如肝肾疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病、肿瘤、严重感染等；有脑梗死病史者；最近3个月内受严重外伤者；近期接收过重大手术者。

1.3 样本采集及处理对照组于体检当日清晨空腹抽取肘静脉血5 mL。观察组于入院第2天、禁食10～12 h后清晨空腹抽取肘静脉血5 mL。室温放置2 h或4℃过夜后于1 000g离心20 min，分离血清标本，密封保存置于-20℃冰箱或者-80℃冰箱保存，避免反复冻融。

1.4 血清中miRNA-503及IGF-1R的表达水平分析取观察组和对照组血清样品，提取所有样本RNA后，使用全式金公司的TransScript Two-Step RTPCR SuperMix（AT401-01）试剂盒进行反转录，获得cDNA。

根据GeneBank中miRNA-503的序列（NR_030228.1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成miRNA-503引物，F：5′-TGCCCTAGCAGCGGGAA-3′，R：5′-TACCCTGGCAGCGGAAACA-3′。选用U6基因作为内参，F：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，R：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。将上述cDNA作为模板，按照以下程序在Real-Time PCR仪（ABI 7500，USA）上进行qPCR扩增：95℃，5 min；95 ℃，15 s；60 ℃，30 s；40个循环。采用2-ΔΔCt的方法计算miRNA-503的相对表达量。

取对照组和观察组血清样本，按照人IGF-1R检测试剂盒（96T/48T，上海纪宁酶联科技有限公司）的操作说明，对两组血清样本中的IGF-1R表达水平进行检测。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡以将U87细胞miRNA-503模拟组细胞和miRNA-503对照组细胞以7×103个/孔的密度接种于96孔板中，加入含有10%胎牛血清的高糖DMEM细胞培养液100µL，置于37℃，5%CO2培养箱中培养。培养24 h后，将miRNA-503模拟物以及对照物分别转染细胞中，继续培养48 h，收集细胞，流式细胞术检测各组细胞凋亡情况。重复3次实验。

1.6 Western blot检测U87细胞置于加入含有10%胎牛血清的高糖DMEM细胞培养液中，置于37℃，5%CO2培养箱中培养。各组细胞以3.0×105个/孔的密度接种12孔板，培养24 h后，收集细胞，进行SDS-PAGE蛋白凝胶电泳：浓缩胶恒压80 V，20 min；分离胶恒压120 V，电泳至溴酚蓝到凝胶底部。使用Bio-Rad半干转印槽（Trans-Blot SD，170-3940）在恒压15 V，30 min条件下转印至PVDV膜（生工，F019532-0010）。取下PVDF膜放入封闭液（TBST，5%脱脂奶粉，pH7.4）中室温孵育2 h；使用abcam公司生产的IGF-1R一抗稀释液（ab39398，1∶5 000），Bax一抗稀释液（ab32503，1：5 000），p-Akt一抗稀释液（ab38449，1∶5 000），Bcl-xl一抗稀释液（ab32370，1∶5 000），c-Myc一抗稀释液（ab32072，1∶5 000），p-STAT3一抗稀释液（EP2147Y，1∶5 000）室温孵育PVDF膜1 h；TBST洗膜3次，每次10 min；使用全式金公司生产的HRP标记的二抗羊抗兔IgG稀释液（HS101-01，1∶10 000）室温孵育PVDF膜1 h；TBST洗膜3次，每次10 min；最后根据ECL化学发光液（180-501，上海天能）使用说明，将PVDF膜置于Bio-Rad凝胶成像系统中显影。实验重复3次。

1.7 统计学方法采用SPSS 20.0软件对数据进行统计学分析，计量资料以±s表示，两组间比较采用两独立样本均数的t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。当P＜0.05时认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清样本中miRNA-503及IGF-1R的表达量比较观察组miRNA-503表达量显著低于对照组，而IGF-1R的检测量则显著高于对照组（P＜0.05）。见表1。

表1 急性脑梗死和健康对照血清中miRNA-503及IGF-1R的表达量

2.2 miRNA-503及IGF-1R在HEB细胞和U87细胞中的表达量比较miRNA-503在HEB细胞中的表达显著高于U87细胞（P＜0.05）；IGF-1R在HEB细胞中的表达显著低于U87细胞（P＜0.05）。见图1，表2。

图1 IGF-1R在脑正常胶质细胞（HEB）及胶质瘤细胞U87中的表达

表2 miRNA-503及IGF-1R在脑正常胶质细胞（HEB）及胶质瘤细胞U87中的表达量

2.3 miRNA-503在不同处理的U87细胞中的表达量比较3组细胞中miRNA-503的相对表达量差异有统计学意义（P＜0.05）。其中，miRNA-503在空白对照组和阴性对照组的相对表达量差异无统计学意义（P＞0.05）；与两对照组相比，模拟组细胞中的miRNA-503的相对表达量显著增高（P＜0.05）。见表3。

表3 miRNA-503不同处理的胶质瘤细胞U87中的表达量

2.4 不同处理的U87细胞的凋亡情况比较3组细胞凋亡率差异有统计学意义（P＜0.05）。其中，空白对照组和阴性对照组的凋亡率差异无统计学意义（P＞0.05）；与两对照组相比，模拟组细胞凋亡率显著增高（P＜0.05）。见图2，表4。

2.5 IGF-1R信号通路相关蛋白在不同处理的U87细胞中表达情况比较3组细胞中的各种蛋白表达差异有统计学意义（P＜0.05）。空白对照组和阴性对照组差异无统计学意义（P＜0.05）。与空白对照组相比，IGF-1R、p-Akt、p-STAT3及Bcl-xL等蛋白表达量显著下降（P＜0.05）；而c-Myc和Bax的表达量则显著升高（P＜0.05）。见图3，表5。

图2 三组胶质瘤细胞U87的凋亡情况

表4 不同处理的胶质瘤细胞U87组中细胞的凋亡情况

3 讨论

ACI的发病机制相当复杂，涉及多种机制。临床检测表明，患有不同疾病的病人的血浆miRNA表达不同［8］。多种miRNA在ACI病人血清中存在明显差异，并发挥重要功能［9-11］。miRNA属于非编码RNA，通常由18～25个核苷酸组成，可在转录后调节相关基因的表达。一般可通过降解靶基因mRNA或者抑制蛋白翻译等手段对靶基因进行负调节［12］。目前研究已证实，miRNA可参与细胞发育、分化、生长、增殖以及凋亡等各种生理过程，并且能够参与调节炎性细胞和介质的表达［13-14］。本研究发现，与健康人相比，ACI病人血清中miRNA-503表达水平显著降低，而IGF-1R水平则显著升高。这表明，miRNA-503及IGF-1R极可能参与了ACI的发病过程。

图3 IGF-1R信号通路相关蛋白在不同处理的胶质瘤细胞U87中表达

表5 IGF-1R信号通路相关蛋白在不同处理的胶质瘤细胞U87中表达/±s

表5 IGF-1R信号通路相关蛋白在不同处理的胶质瘤细胞U87中表达/±s

组别空白对照组阴性对照组miRNA-503模拟组F值P值t值（空白对照组比阴性对照组）P值（空白对照组比阴性对照组）t值（空白对照组比miRNA-503模拟组）P值（空白对照组比miRNA-503模拟组）t值（阴性对照组比miRNA-503模拟组）P值（阴性对照组比miRNA-503模拟组）样本数5 5 5 IGF-1R 0.93±0.09 0.90±0.10 0.49±0.05 44.000＜0.001 0.499 0.632 9.556＜0.001 8.2000＜0.001 p-Akt 0.76±0.07 0.81±0.09 0.43±0.05 41.260＜0.001 0.981 0.356 8.578＜0.001 8.253＜0.001 c-Myc 0.51±0.06 0.52±0.05 1.07±0.11 84.640＜0.001 0.286 0.782 9.994＜0.001 10.180＜0.001 p-PI3K 1.06±0.09 0.99±0.10 0.30±0.04 134.300＜0.001 1.163 0.278 17.250＜0.001 14.330＜0.001 Bcl-xL 1.12±0.10 1.11±0.10 0.52±0.07 71.100＜0.001 0.158 0.878 10.990＜0.001 10.810＜0.001 Bax 0.44±0.05 0.45±0.04 1.09±0.11 128.400＜0.001 0.349 0.736 12.030＜0.001 12.230＜0.001

磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路的激活和相关免疫功能调控都与miRNA密切相关［15-16］。研究表明，多种miRNA都可参与该通路的调节［17-18］，且都有IGF-1R的参与［19-21］。IGF-1R是细胞增殖、分裂以及分化中的重要调节因子，能够预防各种细胞的凋亡损伤、诱导血管内皮生长因子的表达等［22］，其高表达与多种恶性肿瘤的发生发展明显相关［23］。现有的研究表明，miRNA-503参与了多种肿瘤细胞的生长调节过程［24］，且都靶向IGF-1R发挥功能［2，4］。

为研究miRNA-503在ACI相关肿瘤疾病中对IGF-1R及其信号通路中的作用，本研究以人脑正常胶质细胞HEB细胞及胶质瘤U87细胞为研究对象，进行了初步探讨。结果发现，与HEB细胞相比，U87细胞中miRNA-503表达水平显著降低，而IGF-1R水平则显著升高。进一步证实了miRNA-503及IGF-1R在肿瘤细胞发展中起着重要作用。在U87细胞中过表达miRNA-503以后，细胞凋亡率增加，细胞增殖受到明显抑制。有文献报道，IGF-1R活化后，可以激活PI3K、Akt等信号分子，进而增强细胞的增殖和迁移能力［22］，Bcl-xl和Bax的表达变化与细胞凋亡密切相关［25］。本实验中Western blot结果显示，PI3K/Akt信号通路中关键蛋白p-Akt、Bcl-xl和p-PI3K显著降低，与IGF-1R表达降低一致；而c-Myc和Bax显著升高，与细胞凋亡率增加一致。结果表明，miRNA-503表达水平升高，可抑制IGF-1R的表达，进而阻碍了PI3K/Akt信号通路的激活，同时Bcl-xl/Bax比例下降，共同致使癌细胞增殖减慢，凋亡增加。

本文尚且存在不足之处：（1）本文仅在细胞学水平对miRNA-503对IGF-1R的生物学功能进行了初步探讨，并代替体内真实状况，需要相关的动物模型，进一步验证本文的结论。（2）CAI的发病机制比较复杂，miRNA-503影响的信号通路可能是多方向的，活血也有其他miRNA分子的参与，因此在今后的研究中需要验证其他信号通路的激活及miRNA分子表达。

综上所述，在急性脑梗死病人血清中，miRNA-503呈现高水平表达，而IGF-1R则呈现低水平表达。miRNA-503在U87细胞中的过表达能够抑制细胞增殖，可能是通过抑制IGF-1R表达，进而调节PI3K/Akt通路中相关蛋白表达，从而抑制了U87的增殖。