60Co-γ辐射种子处理对‘龙牧806’苜蓿幼苗耐盐性的影响

李 波，方志坚，李 红，杨 瞾

(1. 齐齐哈尔大学生命科学与农林学院，抗性基因工程与寒地生物多样性保护黑龙江省重点实验室，黑龙江 齐齐哈尔 161006；2. 黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院，黑龙江 齐齐哈尔161005)

苜蓿(Medicagosativa)是世界上栽培最多的多年生豆科植物之一，具有高产、营养价值高、适应性广等特点[1-2]。在国内外广泛种植，是我国土壤盐碱化地区研究的重要牧草之一，在改良盐碱化土壤和促进农业的可持续发展方面具有潜在的经济价值[3]。土壤盐渍化是限制牧草产量和品质的重要因素之一，因此，深入研究苜蓿的抗盐碱能力，扩大苜蓿种植范围，提高生产力，对促进土壤盐碱化地区畜牧业的经济发展具有重大意义[4-5]。

60Co-γ辐射诱变育种是一种创造新品种和新种质的重要手段[6]，目前诱变育种广泛应用于多种牧草，通过幼苗生理生化指标的变化来探究辐射对牧草的影响，王月华等[7]发现50 Gy剂量60Co-γ辐射处理草地早熟禾(Poapratensis)能够提高超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)和过氧化物酶(Peroxidase，POD)活性；张玉等[8]发现100～150 Gy剂量能够提高菊苣(Lactucasativa)幼苗中可溶性糖(Soluble sugar，SS)、可溶性蛋白(Soluble protein，SP)含量和SOD等酶活性，在辐射剂量高于150 Gy时表现为明显抑制。Qi等[9]发现，50 Gy剂量的60Co-γ射线可以提高拟南芥(Arabidopsisthaliana)幼苗的耐盐性并减轻其盐害程度，同时，高睿等[10]发现100 Gy剂量60Co-γ射线能显著提高乌拉尔干草(Glycyrrhizauralensis)种子苗期各生理指标并提高其耐盐性。处于逆境中的植物会大量积累H2O2和O2-，从而导致膜质和蛋白质发生氧化损伤，代谢速率变慢[11]。因此，植物会通过改变抗氧化酶系统来减轻活性氧对细胞膜及胞内大分子的损伤，降低逆境对植物造成的伤害[12-13]。60Co-γ射线辐射是一种常见改良作物并提高其抗逆性的一种手段[14]，但利用60Co-γ射线辐照诱变苜蓿对其耐盐性的研究却鲜有报道，因此，本研究从60Co-γ辐射对苜蓿耐盐性影响的角度出发，探讨不同剂量的60Co-γ辐射对苜蓿幼苗渗透调节物质、膜透性物质及抗氧化酶活性的影响，以期了解幼苗对辐射的响应，从而为苜蓿抗逆机制的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以黑龙江省畜牧研究所提供的经过4种60Co-γ辐射剂量(600 Gy，900 Gy，1 200 Gy，1 500 Gy)的‘龙牧806’苜蓿种子为材料。辐射源由中国农业科学研究院原子能利用研究所提供，辐射剂量依次为600，900，1 200和1 500 Gy，剂量率15 Gy·min-1，每份处理50 g种子，以同一批次相同数量未经处理的种子作为对照。

1.2 方法

1.2.1幼苗的培养 挑选籽粒饱满的苜蓿种子，采用土培的方法种植在营养钵中(针叶土、营养土和珍珠岩按1∶2∶0.5比例进行混合)，每3 d浇1次水，待苜蓿幼苗生长45 d后，将幼苗从土中取出。

1.2.2NaCl胁迫处理 用清水将各处理组及对照苜蓿幼苗根部清洗干净，然后将其于1/2 Hoagland营养液中培养4～5 d。培养完毕后再将其放在质量浓度为0.75%的NaCl溶液中处理72 h。每次处理各组长势均匀的苜蓿幼苗15株，共3次重复，将植株根和叶片分开，置于密封袋中，保存于—80 ℃冰箱中备用，并对苜蓿的叶片及根进行生理生化指标的测定。

1.2.3生理生化指标的测定方法 苜蓿幼苗各生理生化指标的测定方法参照王学奎[15]和高俊凤等[16]的方法，具体如下：可溶性蛋白(SP)含量测定采用考马斯亮蓝法、脯氨酸(Proline，Pro)含量测定采用酸性茚三酮法、可溶性糖(SS)含量测定采用蒽酮法、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量测定采用硫代巴比妥酸法、相对电导率(Relative conductivity，RC)测定采用浸泡法、过氧化物酶(Peroxidase,POD)活性测定采用愈创木酚比色法、多酚氧化酶(Polyphenol oxidase，PPO)活性测定采用比色法。

1.2.4数据处理及分析 用Excel 2010软件进行作图，用SPSS 17.0软件进行数据处理及相关分析。

采用隶属函数法对不同60Co-γ辐射剂量处理的苜蓿幼苗生理生化指标进行综合分析，隶属函数值计算公式：R(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)，反隶属函数计算公式：R(Xi)=1-(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)，式中，Xi为指标测定值，Xmin、Xmax为某项指标的最小值和最大值。

2 结果与分析

2.1 不同60Co-γ辐射剂量对NaCl胁迫下苜蓿幼苗渗透调节物质的影响

如图1A所示，苜蓿叶片和根可溶性蛋白(SP)含量随辐射剂量的增加呈现先升后降的趋势，在600 Gy组含量最高，分别为70.45 mg·g-1和32.97 mg·g-1，比对照组增加18.22%和21.60%，辐射剂量为1 200 Gy和1 500 Gy时，叶片中SP含量比对照分别减少6.05%和24.04%；而根中SP含量比对照分别减少27.25%和40.04%，且苜蓿叶片SP含量均高于根。方差分析结果显示，辐射组苜蓿叶片的SP含量与对照比较差异均不显著(P>0.05)，而根的SP含量与对照比较差异均显著(P<0.05)。600 Gy辐射剂量有利于苜蓿叶片和根SP含量的积累。

如图1B所示，苜蓿叶片和根脯氨酸(Pro)含量随辐射剂量的增加呈先升后降的趋势，600 Gy和900 Gy辐射处理下，叶片中Pro含量为257.30 μg·g-1和233.69 μg·g-1，比对照增加17.33%和6.56%，而根中Pro含量为239.93 μg·g-1和213.87 μg·g-1，比对照增加23.47%和10.06%；当辐射剂量为1 200 Gy和1 500 Gy时，叶片中Pro含量与对照组相比减少21.17%和33.17%，而根中Pro含量较对照组减少31.57%和52.38%，且叶片Pro含量均高于根，与对照组比较差异均显著(P<0.05)。600 Gy和900 Gy辐射剂量有利于苜蓿叶片和根Pro的积累。

如图1C所示，苜蓿叶片和根可溶性糖(SS)含量随着辐射剂量的增加呈现先升后降的趋势，600 Gy组SS含量最高，分别为19.71 mg·g-1和16.71 mg·g-1，比对照增加39.94%和24.53%，而900 Gy，1 200 Gy和1 500 Gy组叶片SS的含量分别比对照减少了17.75%，24.85%和31.66%；根SS的含量分别比对照减少了5.44%，29.35%和44.94%。除根900 Gy组与对照比较差异不显著外(P>0.05)，其余各辐射组均与对照组比较差异显著(P<0.05)。600 Gy辐射剂量有利于苜蓿叶片和根SS含量的积累。

图1 NaCl胁迫下60Co-γ辐射龙牧806苜蓿叶片和根渗透调节物质的变化

2.2 不同60Co-γ辐射剂量对NaCl胁迫下苜蓿幼苗膜透性物质的影响

如图2A所示，苜蓿叶片和根丙二醛(MDA)含量随辐射剂量的增加呈现上升趋势，对照组MDA含量最低，分别为22.98 μmol·g-1和14.03 μmol·g-1，600～1 500 Gy组叶片MDA含量分别比对照增加19.23%，39.17%，60.72%，109.17%；而根MDA含量分别比对照增加23.69%，66.93%，91.07%，175.99%；高剂量(1 200 Gy和1 500 Gy)组的MDA含量与对照组相比差异显著(P<0.05)。辐射处理导致苜蓿叶片和根部细胞膜的损伤，使各辐射组叶片和根的MDA含量均高于对照组。

如图2B所示，苜蓿叶片和根相对电导率(RC)随辐射剂量的增加呈现逐渐增加的趋势，对照组RC最低，为55.54%和43.15%，1 500 Gy组RC最高，分别为89.09%和86.97%。在经过不同剂量的60Co-γ辐照处理后，叶片RC分别比对照增加21.52%，35.43%，52.64 %和60.41 %，而根RC分别比对照增加39.01%，67.61%，80.45%和101.55%，且与对照比较差异均显著(P<0.05)。

图2 NaCl胁迫下60Co-γ辐射龙牧806苜蓿叶片和根膜透性物质的变化

2.3 不同60Co-γ辐射剂量对NaCl胁迫下苜蓿幼苗抗氧化酶活性的影响

如图3A所示，苜蓿叶片和根过氧化物酶(POD)活性均随辐射剂量的增加呈现先升后降的趋势，600 Gy组的叶片和根POD活性最高，为19 966.67 U·g-1FW·min-1和24 333.33 U·g-1FW·min-1，比对照组增加20.77%和32.97%，且与对照相比差异显著(P<0.05)，1 200 Gy和1 500 Gy组的叶片和根POD活性分别比对照减少35.69%和45.77%，而根POD活性分别比对照减少10.20%和39.16%。600 Gy和900 Gy剂量处理促进苜蓿叶片和根POD活性的增加。

如图3B所示，苜蓿叶片和根的多酚氧化酶(PPO)活性均随辐射剂量的增加呈先升后降的趋势，600 Gy组PPO活性最高，为1 686.67 U·g-1FW·min-1和2 523.33 U·g-1FW·min-1，与对照组的PPO活性相比增加108.23%和159.25%，叶片 900 Gy,1 200 Gy和1 500 Gy的酶活分别比对照增加43.62%,29.63%和11.52%，仅600 Gy辐射组叶片的PPO活性与对照相比差异显著(P<0.05)，根部900 Gy和1 200 Gy组PPO活性比对照高出144.52%和58.22%，且与对照组相比差异显著(P<0.05)，仅1 500 Gy组的酶活比对照降低8.90%。600 Gy，900 Gy和1 200 Gy组根的PPO活性与对照相比差异显著(P<0.05)，600～1 200 Gy辐射剂量可促进苜蓿的叶片和根PPO活性增加。

图3 NaCl胁迫下60Co-γ辐射龙牧806苜蓿叶片和根两种抗氧化酶的变化

2.3 苜蓿幼苗叶片和根系各生理生化指标相关性分析

表1对盐胁迫下各测定指标之间做相关性分析，可以看出各指标间的相关程度各不相同。叶中Pro与SP和POD、POD与SP、PPO与MDA之间均呈极显著正相关，相关系数分别为0.969，0.965，0.997和0.967，MDA与RC呈显著正相关，相关系数为0.937。根中POD与SP，SS与Pro均呈极显著正相关，相关系数分别为0.997和0.965，SS与SP和POD呈显著正相关，相关系数分别为0.938和0.930，MDA与RC呈显著正相关，相关系数为0.927，其它各指标间均存在一定程度的正相关或负相关。

表1 各指标相关系数矩阵

注：*代表在0.05水平上显著相关，**代表在0.01水平上显著相关

Note:* represents significant correlation at the 0.05 level,and **represents significant correlation at the 0.01 level

2.4 苜蓿幼苗叶和根各生理生化指标隶属函数分析

应用隶属法对NaCl胁迫下不同辐射处理的苜蓿种子的幼苗叶片和根生理生化指标进行综合分析得出(表2)，苜蓿幼苗叶片和根对NaCl抗性由强到弱依次为：600 Gy>0 Gy>900 Gy>1 200 Gy>1 500 Gy。隶属函数综合评价值越大，表明对苜蓿幼苗渗透调节物质积累越多、抗氧化酶活性越高及对膜损伤越小。依据辐射苜蓿种子的幼苗叶片和根生理生化的变化可知600 Gy辐射剂量可以提高苜蓿对NaCl的抗性。

表2 叶和根各指标隶属函数值

3 讨论

植物苗期是对盐胁迫做出反应的敏感时期，植物各项生理生化指标的变化可以直接反映盐害程度。盐胁迫下，植物会出现盐害症状，盐害主要为离子毒害以及渗透胁迫[17-19]。为了维持植物自身正常的生理代谢，植物会通过渗透调节方式来降低盐害的影响[20]。通过测定SS,SP,Pro等植物渗透调节的指标来反映植物的抗盐能力。

本试验研究结果表明，不同剂量60Co-γ射线辐射，对NaCl胁迫下的苜蓿幼苗的SP，SS，Pro的影响作用不同。植物体内SS，SP和Pro的含量与植物的抗逆性有关，逆境环境下，植物自身会主动积累这些物质以适应外界环境的变化，对植物起着保护作用，达到自我修复的效果[21]。此外，SS和SP是生物体的重要组成部分，在植物的发育与代谢中具有重要作用[22]。盐胁迫环境下，植物体内SS和Pro会大量积累，以减少逆境环境对植物自身造成的伤害。随着辐射剂量的增加，各生理指标均呈先上升再下降的变化趋势，其中SP和Pro含量在剂量600 Gy和900 Gy时高于对照组，说明低辐射剂量下苜蓿幼苗能进行自我修复，提高其对辐射的损伤，但随辐射剂量的增加，修复效果减弱，该结果与滕娟等[23]研究60Co-γ辐射对三七(Panaxnotoginseng)幼苗特性影响的结果一致。低剂量的辐射处理下，苜蓿幼苗中的脯氨酸等渗透调节物质含量明显高于对照组，这说明辐射处理可以在一定程度上提高苜蓿幼苗的渗透调节能力，从而提高植物的耐盐性。MDA是膜脂过氧化产物，可以反映植物膜质氧化度及植物遭受逆境伤害的程度，其含量越高膜脂过氧化程度越大[24]。植物细胞膜具有选择透性，逆境胁迫时，细胞膜受损导致电解质外渗，因此当植物受伤害愈严重，外渗出的物质就会变多导致介质导电性也变强，最终电导率就会升高，测得相对电导率的高低代表膜的透性强弱。本研究表明随着辐射剂量的升高MDA和RC均呈上升的趋势，细胞膜损伤加重，破坏膜系统的完整性，李瑜等[25]研究60Co-γ辐射对桂花(Osmanthusfragrans)生理指标影响也得到了相似结论，这说明，低剂量的辐射虽然可以一定程度上提高植物的耐盐性，但辐射还是会引起苜蓿幼苗细胞膜脂的过氧化作用，以及在一定程度上破坏脂膜透性，并且随着剂量的增加，膜脂过氧化作用加剧。

在NaCl胁迫下，为适应盐胁迫条件对苜蓿的影响，苜蓿体内抗氧化酶POD、PPO等可缓解因逆境对植物造成的伤害，这些抗氧化酶的活性可以反映植物自身清除活性氧的能力，也代表植物抗逆性的强弱[26]。POD是植物生命代谢中重要的抗氧化酶，参与清除由逆境植物体内产生的活性氧，减少植物细胞受到损害，本试验中，辐射剂量为600 Gy时，POD活性达到最大，说明在此剂量下POD清除细胞内活性氧的能力最强，从而缓解了盐胁迫对苜蓿的活性氧氧化损伤作用，辐射剂量继续增加，活性氧清除能力减弱，氧代谢平衡失调，导致酶活性下降[27]。PPO也是植物中常见的一种酶，在植物完好时PPO无活性，但是当植物受到损伤时便表现出活性，本试验在盐胁迫条件下苜蓿受到了盐害，导致PPO活性增强，由于根部与盐环境直接接触，从而导致苜蓿根部的POD，PPO的活性要大于叶片的POD和PPO活性，这说明苜蓿根部对辐射的敏感性在一定程度上要大于其叶片的敏感性[28]。通过对苜蓿幼苗各指标进行隶属函数的综合分析，可以发现低辐射剂量(600 Gy)有利于提高苜蓿的耐盐性。

4 结论

60Co-γ射线对盐胁迫下的‘龙牧806’苜蓿幼苗生理生化指标的影响较明显，即低辐射剂量(600 Gy)能够促进SS等渗透调节物质的积累，减少膜损伤，同时，抗氧化酶活性升高，活性氧清除能力增强，保持活性氧代谢平衡。随着辐射剂量的增加，膜系统完整性遭到破坏，电解质外渗导致MDA含量和RC上升。相关性分析结果表明，叶中Pro与SP和POD、POD与SP、PPO与MDA之间均呈极显著正相关，根中POD与SP，SS与Pro均呈极显著正相关。隶属函数综合分析可知，600 Gy是‘龙牧806’苜蓿诱变育种较合适剂量。