天祝县燕麦叶斑病的发生情况及其病原鉴定

聂秀美，赵桂琴，孙浩洋，柴继宽，吴文斌，林 龙, 孙雷雷，王 军，王苗苗，康晓强

(甘肃农业大学草业学院，草业生态系统教育部重点实验室，中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州 730070)

燕麦(Avenasativa)是禾本科燕麦属一年生世界性栽培作物[1]，具有广泛的生态适应性、丰富的营养价值和独特的保健功能[2-3]，在我国主要分布于西南、华北、西北等高寒冷凉地区[4]，对我国畜牧业生产、农业结构调整、生态环境改善等方面具有重要意义[5-6]。

燕麦叶斑病(Drechsleraavenacea)又称条纹叶枯病，主要为害燕麦叶片和叶鞘，发病初期病斑呈灰绿色水渍状，随着病情加重，渐变为浅褐色至红褐色椭圆形病斑。在低温高湿环境中，病斑还可扩展成不规则形条斑甚至融合成片，导致叶片枯死脱落，严重影响燕麦的生产性能和饲用价值[7]。其病原菌多以分生孢子或菌丝在田间病残体上越冬，第2年回春时产生的病原物可从幼嫩组织侵入燕麦植株体，发病后的燕麦植株所携带的致病菌菌丝或分生孢子又可反复进行多次侵染[8]。该病害在燕麦重病田的发病率高达90%以上，在美国、加拿大、波兰等国家都是燕麦生产中的主要病害，在巴西被认为是流行最快的病害，可危害燕麦的幼苗、叶片及种子，一般减产5%～10%，重者可达30%以上[9-11]。

燕麦叶斑病尽管在很多国家都有发生，但都鲜见报道，我国对这种病害的研究报道更少，仅见袁军海等[12]于2013对河北省张家口市的51个燕麦品种进行叶斑病抗性鉴定，其结果表明不同品种间的抗病性差异较大，病叶率为70.83%～100%，病情指数为20.31～84.87，仅4个燕麦品种表现为中度抗病。东保柱[13]在内蒙古武川县和河北坝上对两地共有的39个主栽燕麦品种进行研究表明，不同品种对叶斑病的抗性不同，同一品种在不同地区的抗性表现也存在差异，如‘白燕2号’在河北表现为免疫，在内蒙古表现为髙抗；‘坝燕4号’、‘坝莜8号’、‘埂莜5号’在河北表现为中感，在内蒙古表现为高感。刘万友[14]对不同栽培条件下燕麦叶斑病的发病情况进行研究表明，播期是影响该病害的最主要因素，通过利用不同杀菌剂进行试验表明40%的多菌灵对该病害具有较好的防治效果，且拌种处理较叶面喷施效果更好。张笑宇等[15]采用组织分离法从内蒙古自治区武川县和河北省张家口市张北县采集的燕麦叶斑病病叶中共分离培养出3株菌株，鉴定表明这3株病原菌均为燕麦内脐蠕孢菌(Drechsleraavenae)，其有性态为燕麦核腔菌(Pyrenophoraavenae)。天祝藏族自治县地区是甘肃省的主要畜牧业基地之一，具有典型的农牧交错区特点。燕麦是该区域主要的栽培牧草，也是当地家畜冷季补饲的主要饲草来源。但近年来，该地区燕麦叶斑病逐年加重，严重影响当地燕麦产业的发展。因此，本研究拟通过对天祝县燕麦叶斑病的发生情况进行调查，对采集到的病叶进行病原菌的分离和鉴定，以明确叶斑病在天祝县的发生情况，确定病原菌种类，为当地燕麦叶斑病病害的进一步研究和防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 病害调查

于2018年7月对甘肃省天祝县松山镇黑马圈河村(103°40′ E，37°17′ N，海拔2 885 m)、东大滩乡上泉村(103°42′ E，37°20′ N，海拔2 699 m)和酸茨沟村(103°30′ E，37°25′ N，海拔2 653 m)、安远镇柳树村(102°85′ E，37°25′ N，海拔2 708 m)、抓喜秀龙乡南泥沟村(102°79′ E，37°21′ N，海拔2 866 m)种植的甜燕麦品种进行了田间叶斑病发生情况的调查。每个点随机选取3块样地，避开地边5 m，采用“Z”字型5点取样法，每点调查燕麦植株的上部、中部、下部共计50片叶，逐片记录发病情况，并进行病叶率和病情指数的计算。叶斑病的病叶率、病情指数的计算和评价标准参照袁军海等[12]的计算方法和评价标准，病级划分标准见表1。

病叶率(%)=病叶数/调查叶片总数×100

式中：S为病情指数；i为病级数(1～n)；Xi为病情为i级的单元数；Si为病情为i级的严重度值。

表1 燕麦叶斑病病级划分标准

1.2 病原菌鉴定

1.2.1病原菌的分离培养 将采集的燕麦病叶标本带回实验室后，参照Xue等[16]和李戌清等[17]的方法在病健交界处选取具有典型叶斑病症状的组织，经自来水冲洗，用70%酒精表面消毒1 min，5%次氯酸钠消毒5 min，无菌水冲洗3～5次后用灭菌滤纸吸干表面水分，再剪成5 mm的小块，随机选择5块均匀放在直径90 mm的马铃薯葡萄糖琼脂(Potato dextrose agar，PDA)平板上，5皿为1重复，4次重复，置25℃恒温培养箱中黑暗培养。待长出菌丝后及时进行单菌分离和纯化，纯化后的菌株用20%的甘油于—20℃冰箱保存备用。

1.2.2病原菌的致病性鉴定

离体叶片接种 张莉等[18]和张笑宇等[15]的方法进行病原菌的致病性鉴定。选取健康、无病斑的燕麦叶片，自来水冲洗干净，剪取叶片中间5 cm长的叶段，用70%酒精消毒1 min，5%次氯酸钠消毒5 min，无菌水冲洗3～5次后用灭菌滤纸吸干叶片表面的水分。用无菌打孔器在培养7 d的菌株上取直径5 mm的待测菌株块接种于燕麦叶片表面，每皿放4片叶段，每处理重复4次，以接种相同大小的新鲜PDA培养基块为对照。于25℃恒温培养，及时观察发病情况，第4 d对发病燕麦叶片组织进行病原菌的再分离，检验接种前后病原菌是否一致。

活体叶片接种 每盆留苗10株。当燕麦长至3～4叶期时，选取大小一致的3株幼苗，用无菌打孔器在培养7 d的菌株上取直径5 mm的待测菌株块，接种在燕麦叶片第3叶中间，用纱布和保鲜膜固定菌饼，每处理重复4次，以接种相同大小的新鲜PDA培养基块为对照。接种后的燕麦叶片用塑料袋罩住置于25℃，黑暗14 h、湿度95%，光照10 h、湿度75%的恒温保湿培养箱黑暗光照交替培养48 h后取下塑料袋继续培养，观察发病情况。第7 d时对病斑进行病原菌的再分离，检验接种前后病原菌的一致性。

1.2.3病原菌的形态学鉴定 将纯化后的病原菌接种在新鲜PDA平板上于25℃黑暗培养7 d后，观察菌落和分生孢子的形状、颜色和大小等形态学特征进行初步鉴定。

1.2.4病原菌的分子生物学鉴定 采用真菌基因组Omega试剂盒提取菌株DNA，以真菌特异性引物对ITS1和ITS4进行PCR扩增，反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，34个循环后在72℃下再延伸7 min。取PCR扩增产物5 μL,用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测后送样进行测序，所得序列经Clustal W软件进行碱基校对后，与GenBank中已知序列进行相似性比对，用Mega 7.0软件经Bootstrap 1000次循环检验后以邻接法构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 叶斑病的发生情况

通过对天祝县叶斑病发生情况调查发现，各燕麦种植区域的叶斑病发病情况存在明显差异(表2)，发病率为64.20%～99.58%，病情指数介于23.00～61.81之间。松山镇黑马圈河村和东大滩乡上泉村的发病情况最严重，前者的叶斑病病叶率高达92.78%，病情指数为61.81；后者的病叶率最高，为99.58%，病情指数也较高，为60.02。柳树村、南泥沟村、酸茨沟村的发病也较重，其中柳树村和酸茨沟村的发病程度接近，病叶率均为64.51%，病情指数为25.47。南泥沟村的病叶率和病情指数相对较低，分别为64.20%和23.00。

表2 天祝县地区燕麦叶斑病的发生情况

2.2 病原菌的致病性测定

对从燕麦叶斑病病叶上分离获得的菌株通过离体叶片和活体叶片致病性接种试验发现，有6株菌株对燕麦叶片具有致病性，将其依次编号为AS-L-1～AS-L-6。图1为病原菌的致病性表现。离体叶片接种2 d时(图1 A～D)，菌饼周围布满菌丝，叶片接种部位开始出现轻微的褪绿症状，部分接种菌饼的叶片表面逐渐浮现出轻微的病斑，对照无任何变化；接种4 d时(图1 E～H)，菌饼面积明显扩大，叶片出现大面积褪绿现象，接种部位有明显的病斑，叶片表面也开始出现病斑，而对照不发病。活体叶片接种3 d时，接种部位开始显症，有轻微的褪绿现象，叶片表面开始出现菌丝，而接种PDA培养基的对照叶片未发病；接种5 d时，接种部位褪绿现象加重，并出现浅褐色或褐色小斑点；接种7 d时(图1 I)，病斑面积明显扩大，病斑呈褐色或黄褐色，对照未发病。将发病燕麦离体叶片和活体叶片进行病斑再分离，发现所得病原菌与接种病原菌的培养性状和形态特征相同，符合致病菌的柯赫氏法则验证，说明这6株菌株均为燕麦叶斑病的致病菌。

图1 燕麦离体叶片和活体叶片的接种症状

2.3 病原菌的形态特征

对分离到的燕麦叶斑病病原菌在PDA培养基上纯化培养7 d后，进行形态观察，发现其菌落培养特征和孢子形态特征明显不同，部分病原菌的菌落和孢子形态如图2所示。

细交链孢(图2 A～C)菌落生长速度较快，稍隆起，近似圆形，直径约62 mm，表面粗绒状，呈灰褐色，有同心圆，边缘整齐，为白色，气生菌丝浓密。背面黑褐色，边缘褐色。分生孢子单生或串生，倒棍棒状，倒梨形或椭圆形，淡黄褐色至褐色，大小为(9.10～24.20)μm×(3.40～8.50)μm，具纵横隔膜，横隔1～6个，纵隔0～3个。

芽枝状枝孢菌(图2 D～F)的菌落生长速度较慢，平铺，圆形，直径约30 mm，表面粉状，边缘整齐，气生菌丝稀疏，有放射状纹理，整体呈深绿色，背面黑绿色。分生孢子椭圆形，橄榄色，大小为(4.30～8.50)μm×(2.20～4.80)μm，无隔膜。

黑附球菌(图2 G～I)的菌落生长速度缓慢，均匀隆起，近似圆形，直径约25 mm，表面绒状，呈米黄色，气生菌丝浓密，背面焦糖色。分生孢子单生，球形，黄褐色至褐色，大小为1.10 μm×2.50 μm，无隔膜。

燕麦内脐蠕孢(图2 J～L)的菌落生长速度较快，平铺，近似圆形，直径约68 mm，表面粗绒状，中央浅棕色至棕色，边缘乳白色，气生菌丝稀疏，背面中央黑褐色。分生孢子单生，圆柱状，褐色，大小为(10.52～32.47)μm×(3.24～9.63)μm，具横隔3～7个。

2.4 病原菌rDNA-ITS序列系统进化分析

采用真菌ITS区通用扩增引物对ITS1和ITS4对6株致病菌的DNA进行扩增测序，并通过GenBank数据库对这6个菌株的碱基序列同已知物种序列进行同源性比对，结果表明，各比对样品与数据库中序列相似性均在98%以上。进一步采用Mega 7.0软件用邻接法构建系统发育树进行物种间序列比对分析(图3)，结果表明菌株AS-L-1～AS-L-6的rDNA-ITS序列依次与细交链孢(Alternariaalternata(MF1011))、芽枝状枝孢菌(Cladosporiumcladosporioides(KY400091))、燕麦内脐蠕孢(MK632061)、黑附球菌(Epicoccumnigrum(MK632017))、燕麦核腔菌(MK044614)和德氏霉菌(Pyrenophorachaetomioides(MH3992780)) 的亲缘关系最近，单独形成分支。结合形态特征，最终确定AS-L-1～AS-L-6这6个致病菌株分别为细交链孢、芽枝状枝孢菌、燕麦内脐蠕孢、黑附球菌、燕麦核腔菌和德氏霉菌。

通过对6个菌株的rDNA-ITS序列进行聚类分析(图4)表明，6株菌株分属于4个真菌属，其中德氏霉属(Drechslera)3株，分别为燕麦内脐蠕孢、燕麦核腔菌和德氏霉菌；链格孢属(Alternaria)、附球菌属(Epicoccum)和枝孢属(Cladosporium)各1株，分别为细交链孢、芽枝状枝孢菌和黑附球菌。

图3 6个病原菌株的rDNA-ITS序列同已知物种同源序列的系统进化分析

图4 菌株AS-L-1～AS-L-6的rDNA-ITS序列系统发育树

2.5 病原菌的分布情况

由表3可知，不同来源的供试材料携带的病原菌种类存在明显差异，来自安源镇柳树村的材料携带的病原菌株最多，为6株；其次是松山镇黑马圈河村和抓喜秀龙乡南泥沟村的材料，除未携带芽枝状枝孢菌和黑附球菌外，其它4株病原菌均能在这2份材料中检出；东大滩乡上泉村和酸茨沟村材料中分离出的病原菌株相对较少，都仅有3株。另外，从各供试材料中均可分离出细交链孢和燕麦内脐蠕孢，而芽枝状枝孢菌仅在安源镇柳树村材料中分离到。燕麦核腔菌除从东大滩乡上泉村材料中未检出外，在其它材料中均可检测到。

3 讨论

作物在整个生长发育过程中，都会受到各种病害的危害，这些病害主要由病原菌侵染引起[19]。燕麦叶斑病是一种真菌性病害。整个生物界由病原真菌引发的真菌病害约占植物病害的70%～80%，这些真菌具有分布广、种类多、发病快、隐蔽性强、危害重等特性，通常会侵入植物的质外体或细胞获取营养，形成寄生关系，从而使植物致病[20-21]。

病叶率和病情指数是反映植物病害发生情况或危害状况的重要指标。本试验通过对天祝县5个燕麦种植区的叶斑病发生情况调查发现，其病叶率在64.20%～99.58%之间，病情指数变化范围为23.00～61.81，其中黑马圈河村和上泉村叶斑病发病最严重，其它3个调查区域的发病也较重，这与金柳艳等0对在不同环境下的5个相同玉米(Zeamay)品种的病害调查结果类似。植物与病原菌的相互作用是一个复杂的生物学过程，植物对病原菌的防御能力除受植物本身遗传特性的影响外，还可能与其自身对不同地理环境的适应性和管理措施有差异有关[23-24]。本研究通过对不同来源的供试病样进行致病菌检测后发现，在柳树村材料中检出的病原菌种类最多；黑马圈河村和南泥沟村次之；上泉村材料中分离出的病原菌最少，这可能是因为叶斑病致病菌在低温高湿环境中易发生侵染和传播，而且其发生程度与播期、种植密度、施肥量、品种和灌水量等田间管理措施密切相关，但由于在不同地理环境条件下病害发生和流行的致病环境因子存在差异，因此不同调查区域的病害致病菌有所不同[25-26]。本研究是对天祝县不同燕麦种植区域同一燕麦品种的病害情况进行调查，可以说明造成其发病情况存在差异的主要因素是区域间的环境因子和管理措施。

表3 燕麦叶斑病病原菌的分布情况

注：“+”表示从供试材料中可分离到该菌，“-”表示从供试材料中未分离到该菌

Note:“+” indicates the fungus was isolated from the tested materials,“-” indicates the fungus was not isolated from the tested materials

采用柯赫氏法则、传统形态学分类法和rDNA-ITS序列分析法可以准确鉴定致病真菌种类，克服传统分类鉴定方法中致病菌株培养数量多、形态特征复杂和易受外界环境条件影响等因素，从而可以对病原菌进行快速准确的诊断和鉴定[27-28]。本研究通过对燕麦叶斑病病原菌分离物经致病性鉴定、形态学鉴定和分子生物学鉴定，共发现5种不同种类的致病菌，这些菌株与其各自所对应的GenBank库中的序列同源性均在98%以上，具有很近的亲缘关系。进一步对其进行聚类分析后发现，这些致病菌株分为4个真菌属，其中德氏霉属3株，链格孢属、附球菌属和枝孢属各1株。目前，国内仅对由燕麦内脐蠕孢引起的燕麦叶斑病有所报道[15]，对本研究发现的细交链孢、芽枝状枝孢菌和德氏霉菌引起的燕麦叶斑病还未见报道。但已有研究表明，这些病原菌可在高粱(Sorghumbicolor)[29]、芒果(Mangiferaindica)[30]和小麦(Triticumaestivum)[31]等植物上引起叶斑病。因此，本研究新发现的这些病原菌为国内首次报道，关于这些病原菌在燕麦上的发生规律、致病机理及防治措施等还需进一步研究。

基于ITS基因构建的系统发育树对于不同属的真菌鉴别能力较强，在种水平上也有较好的鉴别力[32]。本研究也证实了这一点，能够将待检测菌株在属和种水平上分开。细交链孢和黑附球菌的寄主范围较广泛，易造成严重危害，而且这些病原菌可以通过侵染田间杂草完成其生活史或者越冬，在适宜条件下，进行病原菌的再次传播，成为叶斑病的侵染源[33-34]。因此，及早重视其潜在威胁，加强该病害致病机理方面的研究，筛选和使用高效低毒杀菌剂或生防菌剂，进行田间杂草防除是控制燕麦叶斑病的重要措施。另外，本研究在病原菌的分离过程中发现，病原菌以单独侵染为主，但存在2～3种共同侵染燕麦叶片的现象。这与已有的研究结果类似[35-36]，这可能是因为致病菌对外界环境的适应性具有相似性，能够进行生长和繁殖，而且某些致病菌在产生病斑后对其他病菌的侵入有诱导作用，使复合侵染成为可能[37-38]。因此，还需对燕麦叶斑病致病菌的复合侵染规律进行明确，从而能够制定更好的防控措施。

4 结论

天祝县燕麦种植区的叶斑病发生较严重。5个村镇叶斑病的发病率为64.20%～99.58%，病情指数为23.00～61.81。其中松山镇黑马圈河村和东大滩乡上泉村发病最严重，其病叶率在92%以上，病情指数60以上。引起天祝县燕麦叶斑病的病原菌共有4属5种，分别为燕麦内脐蠕孢、细交链孢、芽枝状枝孢菌、黑附球菌和德氏霉菌。