氧化铝柱-高压液相色谱法测定重庆火锅底料中7种非食用色素及暴露评估

郑连姬，邹勇，张琪，李智，费华熙，钟耕*

1(西南大学 食品科学学院，重庆，400715) 2(重庆食品工业研究所，重庆，400042) 3(重庆市粮油质量监督检验站，重庆，400026)

苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、罗丹明B、对位红、碱性橙都属于化工染料，具有基因突变性[1]和致癌性[2-3]，欧盟国家在食品工业己禁止其作为食用色素[4-6]添加使用，2008年我国卫生部印发的《食品中可能违法添加的非食用物质名单(第一批)》通知中已列入苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、罗丹明B、碱性橙。不法商家在食品生产过程中为降低成本、赋予食品诱人的外观、稳定色泽，违法使用非食用色素，如在辣椒粉、花椒或辣椒酱中使用苏丹红Ⅰ[7-8]、对位红[8]、玫瑰红B[9]。

重庆火锅，又称为毛肚火锅或麻辣火锅，是中国的传统饮食方式，以调汤考究、麻辣鲜香醇厚见长，具有原料多样、荤素皆可、适应广泛、风格独特、营养丰富等特点。重庆火锅所需火锅底料已实现工业化生产，行销国内外[7-8, 10]，火锅底料生产中大量使用辣椒和花椒作为麻辣呈味的主要原料，因而火锅底料中也存在非食用色素非法添加的风险。2005年的“火锅红”食品安全事件[11]、2011年重庆火锅底料罗丹明B事件[12]就是最好的例子。严格食品安全检测，评估暴露风险，对保障食品安全极为重要。

目前报道的非食用色素的检测方法有高效液相色谱紫外检测法[9, 13-15]、高效液相色谱串联质谱检测法[16-18]、高效液相色谱荧光检测法[19-20]、高效液相色谱二极管阵列检测器[21-22]、荧光光谱法[23-24]、紫外可见光谱法[25-26]、酶联免疫法[27-28]、电化学法[29-30]、拉曼光谱法[31-33]、极谱法[34]和薄层色谱法[35]等。我国现行的非食用色素检测的国家标准均是针对单一物质，不能同时测定这几种非食用色素。范文锐等[15]用高效液相色谱法测定豆制品和肉制品中碱性嫩黄O、碱性橙、酸性橙Ⅱ、酸性金黄、玫瑰红B、对位红、苏丹红Ⅰ 7种非食用色素，高洁等[36]利用高效液相色谱法测定酸性红一号、橙黄G、酸性红26、酸性大红GR、金黄粉5种非食用色素，杨琳等[37]采用高效液相色谱法测定辣椒制品中碱性橙和碱性玫瑰精含量，林黛琴等[17]采用液相色谱-串联质谱法快速测定食品中碱性橙Ⅱ、碱性嫩黄O、酸性橙Ⅱ、酸性金黄4种黄色工业染料。这些方法主要针对不含脂肪或含脂肪少的食品或一般的辣椒制品，而火锅底料中含有大量的油脂，为非食用色素的提取带来困难，目前火锅底料中除去油脂最有效的方法是采用凝胶净化渗透色谱法[38]，但此设备价格昂贵、操作较繁琐。

本研究采用无水乙醇、正己烷、丙酮混合溶剂分步提取碱性橙Ⅱ、罗丹明B、对位红、苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ，用中性氧化铝柱净化火锅底料中7种非食用色素，然后采用高效液相色谱法同时测定这7种非食用色素，并采用此方法测定100组重庆火锅底料。由此，基于蒙特·卡罗法(Monet Carlo method)模拟技术的Crystal ball风险评估软件对检测的7种非食用色素进行拟合，建立暴露模型，从此模型中随机抽样1 000次计算暴露评估风险指数，评价摄食重庆火锅底料时7种非食用色素对重庆居民带来的危害概率，为指导重庆火锅的安全食用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苏丹红Ⅰ(纯度99%)、苏丹红Ⅱ(纯度99.66%)、苏丹红Ⅲ(纯度97%)、苏丹红Ⅳ(纯度99.64%)、罗丹明B(纯度95.52%)、对位红(纯度97%)、碱性橙Ⅱ(纯度99.5%)，德国Dr.Ehrenstorfor公司；乙腈(色谱纯)、层析用氧化铝(中性100～200目)，成都市科龙化工试剂厂；正己烷、丙酮、无水乙醇、乙酸铵等试剂均为国产分析纯，重庆特普科技有限公司。

重庆火锅底料：来自重庆市市面上销售的预包装火锅底料及重庆不同地区火锅餐饮店抽取的火锅底料，共100组。

1.2 仪器与设备

Agilent 1100高效液相色谱仪附二极管阵列检测器(DAD检测器)，美国安捷伦公司；KQ-300DE超声波振荡器，昆山市超声仪器有限公司；RE-52A旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；玻璃层析柱(250 mm×10 mm)，重庆特普科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品前处理

1.3.1.1 提取

称取5 g均质样品于100 mL三角瓶中，加入25 mL无水乙醇超声提取20 min，过滤，滤液收集于圆底烧瓶中，用25 mL无水乙醇重复提取1次，合并滤液。在剩余残渣中加入25 mLV(丙酮)∶V(正己烷)=1∶9混合溶液，超声提取20 min，用V(丙酮)∶V(正己烷)=1∶9混合溶液重复提取1次，合并全部的提取液于圆底烧瓶中，置于50 ℃水浴旋转蒸发浓缩至5 mL左右，备用。

1.3.1.2 层析用氧化铝柱制备

层析用氧化铝在105 ℃条件下干燥4 h，于干燥器中冷却至室温，每100 g中加入2 mL水降活，混匀后密封，放置12 h后使用。在层析柱管(250 mm×10 mm)底部塞入一层脱脂棉，干法装入处理过的氧化铝至3 cm高，轻轻敲实后加一层脱脂棉，备用。

1.3.1.3 净化

制备好的氧化铝柱先用10 mL正己烷预淋洗，待液面降至底部脱脂棉顶部时加入上述样品提取液，用5 mL正己烷洗涤烧瓶，洗涤液一并加入氧化铝柱中，用正己烷冲洗柱至流出液无色，再以20 mLV(丙酮)∶V(正己烷)=1∶9混合溶液洗脱，收集洗脱液，再用20 mL无水乙醇洗脱，合并洗脱液，旋转蒸发至干，残留物用正己烷溶解并定容至5 mL，经0.45 μm有机微孔滤膜过滤后上机测定。

1.3.2 色谱条件

色谱柱：XDB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相：A为0.02 mol/L乙酸铵(用冰醋酸调pH值为4.0)，B为乙腈；流速1 mL/min；进样量10 μL；柱温30 ℃；梯度洗脱；参数见表1；检测波长：碱性橙Ⅱ，440 nm；罗丹明B，548 nm；对位红、苏丹红Ⅰ，480 nm；苏丹红Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，520 nm。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Program of gradient elution

1.3.3 测定100组样品中7种非食用色素

按1.3.1中规定的方法处理100组火锅底料，1.3.2规定的方法测定7种非食用色素。

1.4 数据统计与分析

蒙特·卡罗法(Monet Carlo method)属于统计试验的一种方法，主要通过统计抽样实验为各种各样的数学问题提供近似解，也称为随机抽样技术[39]。

根据年龄性别将评估人群划分为：儿童组(7～13岁)，青少年組(14～17岁)，成人组(18～49岁)，老年人组(50～78岁)，每一组分别按性别进行分析。不同人群的食用油消费量和人均体重数据均来源于2009年中国健康与营养调查数据库(China Health and Nutrition Survey，CHNS)[40]。

1.4.1 暴露评估模型

暴露评估模型如公式(1)所示。

(1)

式中：CDI，平均日暴露量，mg/(kg·bw·d)；Cf，化学物质暴露浓度；PIR，人均每日摄入量，kg/d；EF，暴露频率，day/年；ED，暴露持续时间，年；bw，体重，kg；AT，拉平时间，d(AT=ED 年×365 日/年)；ABS，肠胃吸收系数。

1.4.2 暴露评估风险指数[40-41]

暴露评估风险指数如公式(2)所示。

(2)

式中：IFSC，化学物质C的食品暴露安全指数，表示食品安全的影响程度；RfD，化合物质C的每日安全摄入量。

以上公式可用来计算化学物质C的食品安全指数，根据计算结果可以得出其对食品安全的影响程度。可以预期的结果是：

IFSC≪1，化学物质C暴露对食品安全没有影响；

IFSC≤1，化学物质C暴露对食品安全影响的风险是可以接受的；

1

IFSC>10，食品安全影响的风险超过了可接受的限度，需要立即采取措施。

2 结果与分析

2.1 标准品图谱和样品图谱

由图1和图2可知,在色谱条件下标准品碱性橙Ⅱ、罗丹明B、对位红、苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ保留时间分别为4.507、7.531、11.136、12.007、13.659、14.800、17.535 min，加标样品中碱性橙Ⅱ、罗丹明B、对位红、苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ保留时间分别为4.506、7.532、11.141、12.024、13.667、14.798、17.510 min，从加标后样品分析图中可以看出(因购买的火锅底料中未检出非食用色素，加标后的样品作为本实验的样品)，7种非食用色素分离完全，火锅底料中的其他物质对其测定不产生干扰。

图1 七种非食用色素标准图谱Fig.1 Standard chromatogram of 7 non edible pigments

图2 七种非食用色素加标样品图谱Fig.2 Chromatogram of samples with the addition of standards

2.2 吸收波长的选择

通过Agilent 1100高效液相色谱仪附二极管阵列检测器(DAD检测器)在200～600 nm处对7种非食用色素进行全波长扫描，各自最大吸收波长分别为碱性橙Ⅱ 410 nm；罗丹明B 548 nm；对位红 484 nm、苏丹红Ⅰ 480 nm；苏丹红Ⅱ 494 nm、苏丹红Ⅲ 505 nm、苏丹红Ⅳ 520 nm。本实验使用分时间段变波长的方法，分别选择0～7 min、440 nm；7～9 min、548 nm；9～13 min、480 nm；13～20 min、520 nm进行检测。实验结果证明，各组分在上述波长条件下灵敏度高，极少受到杂质干扰。因此分别采用440、548、480、520 nm作为本实验的检测波长。

2.3 流动相梯度条件的确定

采用0.02 mol/L乙酸铵和乙腈作为流动相，从等度条件开始，进行大量的梯度洗脱条件比较，最终确定分离度和峰型较好的梯度条件，见表1。在上述梯度条件下20 min内8个峰完全分离，峰型都较好，无干扰。

2.4 样品前处理条件的确定

2.4.1 提取

提取非食用色素的溶剂有乙醇、正己烷、乙醇和丙酮、甲醇等，研究发现单独使用一种溶剂同时提取7种色素时，提取效果较差，回收率低。碱性橙Ⅱ和罗丹明B极易溶于乙醇和甲醇溶液，因乙醇无毒，故采用无水乙醇提取；对位红和苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ不溶于乙醇，且溶于正己烷溶液，但火锅底料中含有大量的油脂，油脂不分散于正己烷中从而降低色素的提取效果，因此用V(正己烷)∶V(丙酮)=9∶1混合溶液提取对位红和苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。

2.4.2 净化

非食用色素的检测中经常采用固相萃取柱净化提取液，但固相萃取柱成本较高，为了节约成本，本实验采用自制中性氧化铝柱净化提取液，有研究表明[42]中性氧化铝柱净化油脂及杂质的效果较好，回收率高。

2.5 检出限

配制7种混合标准溶液质量浓度为0.10～0.50 μg/mL的标准溶液，测定峰面积，以质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制标准溶液的工作曲线，在此质量浓度范围内，标准品质量浓度与峰面积值均有良好的线性关系，检出限以1/3信噪比评估法计算得出。具体线性方程及相关系数，检出限见表2。

表2 七种非食用色素的线性方程、相关系数(r)、检出限(S/N=3)Table 2 The linear equation, correlation coefficient (r) and detection limit of 7 non edible pigments

2.6 回收率及精密度

采用添加回收的方法，在不含分析物本底的火锅底料基质中测定回收率，按表3中添加高、中、低水平做7次平行样品，测定精密度，结果见表3。结果表明，各非食用色素的回收率在 86%～97%，精密度(RSD)为0.1%～5.2%。

2.7 100组火锅底料中7种非食用色素检测结果

检测结果均为未检出，即小于检出限(LOD值)。为了建立统计模型，检测结果最大值以1/2检出限(LOD)、最小值以0表示。

2.8 火锅底料中危害因子膳食暴露评估

2.8.1 火锅油脂膳食数据和人群体质量数据

火锅底料中50%～70%成分为油脂，7种非食用色素易溶于油脂中，此评估数据采用油脂膳食数据为依据。通过分析CHNS 2009年的调查数据库，获得的不同人群的油脂膳食人群和体质量数据，考虑重庆地区的特殊油脂膳食的情况，本实验火锅油脂膳食的消费量采用表4中的最高消费量数据，体质量为平均分布(表5)。

表3 七种非食用色素加标回收率及精密度Table 3 Spike recovery and precision of 7 non edible pigments

注：ND表示低于检出限(LOD值)。

表4 不同年龄组的油脂膳食水平及体质量数据[40]Table 4 Data of fat intake and body weight in different age groups

表5 不同年龄组的火锅油脂膳食水平及体质量数据Table 5 Data of hot pot oil consumption level and body weight in different age groups

2.8.2 暴露评估模型其他参数确定

利用基于Monte Carlo模拟技术的Crystal Ball软件，对100组火锅底料样品中各检测参数的测定值进行分布拟合，确定最佳拟合分布。7种非食用色素均低于检出限，为了统计分析检测结果以1/2检出限，均匀分布(Uniform)处理,暴露评估模型的相关参数见表6。

表6 暴露评估模拟参数表Table 6 Table of parameters for simulated exposure assessment

2.8.3 7种非食用色素日均暴露量

利用基于Monte Carlo模拟技术Crystal Ball风险分析软件，从暴露评估模型(表6)含量数据库中随机抽取数值计算我国不同年龄阶段人群通过重庆火锅底料摄入7种非食用色素日暴露量的概率分布，单个模拟过程循环 1 000次，得出模拟结果及平均值，结果见表7。

表7 火锅底料中7种非食用色素在不同人群中不同百分位概率下的日均暴露量(CDI)单位：mg/(kg·bw·d)

Table 7 Average daily exposure of 7 non-edible pigments in CDI at different percentile probabilities in different populations

续表7

百分位数7～13岁14～17岁18～49岁50～78岁男女男女男女男女苏丹红Ⅲ平均值9.90E-067.15E-067.23E-066.52E-069.49E-068.97E-066.82E-066.94E-066.49E-065.80E-066.65E-065.79E-0610%1.94E-061.82E-061.68E-061.52E-061.30E-061.20E-061.37E-061.25E-0630%5.75E-065.17E-064.27E-064.33E-063.83E-063.46E-064.02E-063.49E-0650%9.49E-068.95E-066.81E-066.94E-066.47E-065.79E-066.65E-065.78E-0670%1.34E-051.30E-059.86E-069.72E-061.00E-058.32E-069.42E-068.32E-0690%1.89E-051.84E-051.30E-051.29E-051.60E-051.34E-051.27E-051.15E-0595%2.53E-052.50E-051.52E-051.48E-052.44E-052.02E-051.60E-051.45E-05100%3.18E-053.17E-051.73E-051.67E-053.27E-052.71E-051.94E-051.75E-05苏丹红Ⅳ平均值2.35E-062.08E-062.11E-061.88E-062.76E-061.72E-062.11E-061.99E-061.94E-061.61E-061.94E-061.67E-0610%5.35E-073.84E-074.25E-074.26E-074.35E-073.44E-073.47E-073.07E-0730%1.69E-061.02E-061.37E-061.24E-061.16E-069.93E-071.16E-061.02E-0650%2.76E-061.72E-062.10E-061.98E-061.94E-061.61E-061.94E-061.67E-0670%3.91E-062.41E-062.94E-062.82E-062.94E-062.39E-062.70E-062.41E-0690%5.40E-063.26E-063.77E-063.67E-064.72E-063.87E-063.76E-063.23E-0695%7.07E-064.24E-064.35E-064.26E-067.33E-066.34E-064.97E-064.09E-06100%8.74E-065.22E-064.93E-064.85E-069.94E-068.81E-066.19E-064.94E-06碱性橙Ⅱ平均值7.47E-055.40E-055.60E-054.95E-057.83E-057.11E-055.48E-055.31E-056.14E-055.06E-055.35E-054.55E-0510%1.32E-051.34E-059.49E-061.09E-059.44E-068.60E-061.08E-057.77E-0630%4.24E-053.93E-053.29E-053.19E-053.05E-052.55E-053.29E-052.47E-0550%7.41E-056.50E-055.38E-055.16E-055.43E-054.29E-055.22E-054.38E-0570%1.06E-049.49E-057.66E-057.47E-057.70E-056.54E-057.25E-056.15E-0590%1.47E-041.36E-049.86E-059.46E-051.23E-041.00E-049.66E-058.47E-0595%2.09E-041.82E-041.14E-041.10E-042.01E-041.54E-041.29E-041.13E-04100%2.70E-042.27E-041.30E-041.25E-042.79E-042.08E-041.61E-041.41E-04对位红平均值4.38E-063.10E-063.19E-062.89E-064.52E-064.24E-063.18E-063.03E-063.47E-062.91E-063.07E-062.71E-0610%7.57E-077.99E-076.32E-076.17E-075.38E-074.83E-076.22E-075.45E-0730%2.71E-062.32E-061.89E-061.68E-061.68E-061.48E-061.74E-061.54E-0650%4.27E-063.97E-063.18E-062.96E-062.97E-062.52E-062.94E-062.66E-0670%5.90E-065.57E-064.35E-064.21E-064.44E-063.72E-064.14E-063.69E-0690%8.51E-068.13E-065.67E-065.47E-067.10E-065.74E-065.72E-064.91E-0695%1.12E-051.05E-056.55E-066.47E-061.21E-059.52E-067.27E-066.55E-06100%1.40E-051.29E-057.43E-067.47E-061.70E-051.33E-058.82E-068.19E-06

表7结果显示，7～13岁(男、女)通过火锅油摄入罗丹明B、苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ、碱性橙Ⅱ、对位红日均暴露量最高，18～49岁(男、女)次之，然后14～17岁(男、女)、50～78岁(男、女)最低。同一年龄组相比，除14～17岁(女)苏丹红Ⅲ日均暴露量高于14～17岁(男)，其余男性日均暴露量高于女性。

2.8.4 暴露评估风险指数

参考剂量(reference dose, RfD)是指个人可以长时间持续暴露在这个水平而不受到危害的剂量，通常以每千克体重毫克表示[41]。中国疾病预防中心2005年对苏丹红的危害性评估中，动物试验诱发肿瘤所用剂量苏丹红I、苏丹红Ⅱ为30 mg/kg，苏丹红Ⅲ为80 mg/kg，苏丹红Ⅳ为5 mg/kg[43]。2005年欧盟规定，在欧盟成员国，任何工业燃料(苏丹红、对位红等)含量超标的产品必须撤出市场，检测限设在0.5 ～1 mg/kg[44]。国家统计局颁布的2010年国家统计年鉴，2009年我国居民食用植物油和动物油共摄入量为41.4 g/(标准人·日)，即0.041 4 kg/(标准人·日)[45]。假设油脂中含有非食用色素的含量为2005年欧盟规定的检出限最小值0.5 mg/kg、标准体重60 kg的人每天摄入0.041 4 kg食用油，计算每日摄入量为3.45E-04 mg/(kg·bw·d)，远低于苏丹红危害评估中诱发肿瘤所用剂量，因此本文采用3.45E-04 mg/(kg·bw·d)为7种非法食用色素暴露风险评估中RfD。如风险指数低于1就表明无风险。

表8为不同百分位数概率下的风险指数，7种非食用色素的不同年龄组，不同百分位数(P10、P30、P50、P70、P90、P95、P100)下均小于1，通过摄入重庆火锅底料对儿童、青少年、青壮年、中老年居民带来7种非食用色素危害的概率为0%。

表8 不同百分位数概率下的风险指数Table 8 Risk indices with different percentile probabilities

3 结论

本文采用乙醇和V(正己烷)∶V(丙酮溶液)=9∶1分步提取火锅底料中7种非食用色素碱性橙Ⅱ、罗丹明B、对位红、苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ，经氧化铝柱净化提取液中杂质和大量油脂，分时间段变波长条件下(0～7 min, 440 nm；7～9 min, 548 nm；9～13 min, 480 nm；13～20 min, 520 nm)，0.02 mol/L乙酸铵(pH 4.0)和乙腈为流动相，梯度洗脱，用二极管阵列检测器(DAD)检测，外标法峰面积定量。数据表明，本方法操作较为简便、快捷、精密度高，样品分离度好，测定结果准确可靠，灵敏度高，所用试剂成本低，能满足火锅底料中7种非食用色素含量的一次性检测。利用Monte Carlo模拟技术的Crystal Ball软件，对100组重庆火锅底料进行风险评估的结果不同百分位数(P10、P30、P50、P70、P90、P95、P100)下均小于1，表明此次调查、评估摄食重庆火锅底料对不同年龄段居民带来7种非食用色素(罗丹明B、苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、碱性橙Ⅱ、对位红)危害概率为0%。