经典名方三痹汤中龙胆苦苷含量测定方法研究

但宇超，曾琪，马安献，张惠芹，季宗念，严启新

（海王百草堂药业有限公司，河南濮阳 457000）

三痹汤（San Bi Tang），来源于《妇人大全良方》卷三[1]。组方为黄芪、续断、人参、茯苓、甘草、当归、川芎、白芍、生地黄、杜仲、川牛膝、桂心、细辛、秦艽、川独活、防风、生姜以及大枣。三痹汤是一种袪风之剂，其功能是益气活血、补肾散寒、祛风除湿，用于筋脉拘挛、骨节酸痛、日晡潮热[2]、小儿疳积发热，主要有效成分为龙胆苦苷[3]。本实验建立了龙胆苦苷的测定方法，为三痹汤的质量控制提供了实验依据。

1 实验材料

1.1 仪器

1260infinityⅡ安捷伦高效液相色谱仪（openlabcds色谱工作站）；Inetsil-ODS C18色谱柱[4]（4.6 mm×250mm，5.0 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶；安捷伦公司）；METLERTOLED分析天平（十万分之一）；超声清洗仪。

1.2 试剂

对照品龙胆苦苷，购于中国食品药品检定研究院（批号20180114），纯度大于98%；甲醇、乙腈为色谱纯，水为怡宝纯净水。[5]

2 检测方法的建立

2.1 标准溶液的制备[6]

精密称取各对照品适量，加50%甲醇制成混合对照品溶液，质量浓度为20.00μg/mL。

2.2 供试品溶液的制备

取提取物粉末约1.000g，精密称定，加入50%乙醇溶液50.00mL，超声（功率250W，频率40kHz）提取30min，冷却，再次称量，用50%乙醇溶液补足减失的量，摇匀，过滤，取滤液用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.3 色谱条件

采用Inetsil-ODS C18（4.6mm×250mm，5 μm）色谱柱，柱温25℃，流动相为乙腈-0.05%磷酸水溶液[7]，梯度洗脱（见表1），流速1mL/min，检测波长250nm，进样量10μL，洗脱时间60min。

表1 梯度洗脱设置

2.4 精密度考察

精密吸取同一份三痹汤供试品溶液10μL连续进样6次，以龙胆苦苷为参照峰，计算保留时间RSD和相对峰面积RSD均小于2%，相似度均大于0.99，表明该方法重复性良好，见表2、表3。

表2 龙胆苦苷日内精密度

表3 龙胆苦苷日间精密度

2.5 重现性考察

取同一个批次三痹汤样品6份，按照2供试品溶液制备方法制备三痹汤供试品溶液，每份3个平行，按照2.3中色谱条件分别进样，记录峰面积，其RSD范围在1.23%～2.14%，表明方法重复性良好。见表4。

2.6 稳定性考察

精密吸取同一份供试品溶液，按2.3中色谱条件，分别在0、1、2、4、8、12、24、48 h和72h进样10 μL，记录色谱图，以龙胆苦苷为参照峰，计算得保留时间RSD和相对峰面积RSD均小于2%，相似度均大于0.99，表明供试品溶液72h内稳定，见表5。

表4 重现性考察

表5 稳定性考察

2.7 三痹汤中主要成分龙胆苦苷的含量测定

2.7.1 系统适应性试验

混合对照品和提取物供试品溶液按照2.3中色谱条件分析，分离度均大于1.5，理论塔板数大于5000。混合对照品和供试品溶液色谱图如图1、图2所示。

2.7.2 线性范围考察

将以上制造的混合对照品，稀释成系列不同梯度浓度的对照品溶液，按照3中色谱条件依次注入液相色谱仪测定峰面积，以峰面积和浓度进行线性回归。结果见表6。

图2 供试品溶液色谱图

表6 龙胆苦苷浓度与峰面积线性表

线性回归方程为：y=27.739x+0.2649，R=0.999，符合要求。

2.7.3 回收率试验

取重复性试验同批样品，分别按照近似0.8∶1、1∶1、1.2∶1添加龙胆苦苷对照品，加入样品中，按照2.2进行样品制备，按照2.3中色谱条件进行分析测定，计算平均回收率为98.4%～101.5%，RSD在1.23%～2.02%，表明方法回收率良好，见表7。

表7 龙胆苦苷回收率

2.7.4 检测限与定量限

龙胆苦苷的仪器检测限为0.005483 μg/mL，定量限为0.01845 μg/mL。

2.7.5 样品含量测定

精密吸取2.2中供试品溶液，按2.3中色谱条件进行测定，得到龙胆苦苷化合物峰面积，以外标法计算含量，结果见表8。

表8 含量测定结果

3 结论

该方法建立了对三痹汤中的龙胆苦苷含量测定方法，通过方法学验证表明，该方法的精密度、稳定性和回收率等均符合要求，可以用于三痹汤质量龙胆苦苷的控制环节。