厄洛替尼对大鼠小肠上皮细胞跨膜转运的影响

2019-11-07刘治芳朱艳妮

生物化工 2019年5期

刘治芳，朱艳妮

（长沙医学院，湖南长沙 410219）

厄洛替尼又称特罗凯，适用于两个或两个以上化疗方案失败的局部晚期或转移的非小细胞肺癌的三线治疗，是一种选择性EGFR-TKI（表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂），通过阻断非小细胞肺癌细胞生存、增殖中的某些信号转导通路而发挥作用[1]。但是，厄洛替尼在临床应用中常引发皮疹、腹泻等毒副反应，导致患者营养吸收障碍，甚至出现胃肠道出血。因此，本文旨在探讨厄洛替尼对大鼠小肠上皮细胞跨膜转运的影响，通过多次灌胃给予大鼠厄洛替尼，观测大鼠体重及摄食量的变化，并建立在体肠循环及药动学模型，考察厄洛替尼对合用药物吸收的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SD大鼠12只，体重（200±20）g，雌雄各半，由长沙市天勤生物技术有限公司提供。

1.2 仪器与试剂

高效液相色谱仪（美国，安捷伦公司）；荧光分光光度检测器（日本岛津RF-5301PC）；冷冻离心机（长沙英泰）；超纯水机；pH计。

厄洛替尼原料药（南京安格医药化工有限公司）；荧光素钠（北京索莱宝科技有限公司）；头孢克洛对照品（中检所）；头孢克洛胶囊（上海健坤）；β-羟乙基茶碱对照品（东京株式）。

1.3 方法

1.3.1 厄洛替尼对荧光素钠大鼠在体肠循环的影响

对12只SD大鼠进行随机分组，对照组和给药组均为每组6只（雌雄各半）。每天灌胃给予给药组大鼠30mg/（kg·d）厄洛替尼混悬液，给予对照组大鼠同体积生理盐水，每天1次，连续灌胃7天，并每天记录大鼠的体重与摄食量的变化。

第8天，将大鼠禁食12h进行在体肠循环试验。每只大鼠采用腹腔注射乌拉坦溶液麻醉后固定，沿大鼠腹部中线打开腹腔（约3cm），在十二指肠上部至空肠下部（约20cm）各切一小口，插入循环管，先用注射器将37℃的生理盐水（150 mL）缓缓注入肠管，洗净肠管内容物，再注入空气排净生理盐水，将循环管接通蠕动泵，形成回路。

循环液为5μg/mL的荧光素钠溶液20mL置于锥形瓶（恒温37℃），先以5mL/min循环10min后，将流速调节为2.5mL/min，立即自供试液锥形瓶中取样 100μL，并及时向锥形瓶中补加100μL空白K氏液（恒温37℃），之后每隔30min按同法取样及补加K氏液，共取样9次，停止循环。

向各采血时间点样品中加入2mL纯水，采用荧光分光光度计测定荧光强度，设置发射波长515nm，激发波长490nm，根据标准曲线计算出荧光素钠的浓度，进而得到荧光素钠的各时间段吸收量Qt，公式为：

式中，Ct为各时间点荧光素钠的浓度（μg/mL），Vt为各时间点荧光素钠的体积（mL），l为肠段长度（cm），d为肠段直径（cm）。

1.3.2 单次灌胃给予厄洛替尼对头孢克洛药动学的影响

对12只SD大鼠进行随机分组，对照组和给药组均为每组6只（雌雄各半），其中对照组给予单次灌胃生理盐水和50mg/kg头孢克洛水溶液，给药组给予单次灌胃13.5mg/kg厄洛替尼混悬液和50mg/kg头孢克洛水溶液。在给药前和给药后进行眼眶取血0.5 mL，采血时间点分别为0、10 min、20 min、30 min、45 min、1.0h、1.5h、2.0 h、3.0h、4.0 h、5.0 h、6.0 h。立即分离血浆，精密移取100μL血浆样本于EP管中，加入适量冰醋酸以增加稳定性。

采用HPLC-UV法进行测定血浆中的头孢克洛，以β-羟乙基茶碱为内标，每100μL血浆样本加入20μLβ-羟乙基茶碱（5mg/L），涡旋混匀30 s，再加10%高氯酸甲醇溶液30μL，涡旋混匀3 min，12 000 r/min低温离心10 min，精密吸取上清液进样分析。

测试条件：C18柱（4.6×150 mm，5μm，Agilent公司，美国）；流动相：醋酸水溶液（pH3.2）∶甲醇=80∶20（v/v）；流速：1 mL/min；检测波长：265nm；柱温：30℃；进样量：40μL。

2 结果与分析

2.1 厄洛替尼对大鼠体重及摄食量的影响

记录对照组及给药组大鼠的体重与摄食量的变化，并进行统计分析，差异结果表示为*p＜0.05，见图1。

图1 对照组及给药组大鼠体重及摄食量的变化（n=6）

给予厄洛替尼后，与对照组相比大鼠的体重及摄食量均显著降低，第7天给药组和对照组的平均体重分别为（229.8±24.1）g和（252.0±30.2）g。给药组大鼠的平均每天摄食量为（16.7±3.9）g，显著低于对照组（25.1±5.6）g。

A对照组及给药组大鼠体重的变化B对照组及给药组大鼠摄食量的变化。

2.2 厄洛替尼对荧光素钠大鼠在体肠循环的影响

通过公式计算得到Qt，进而将各时间点前所有时间段吸收量Qt累加，得到各时间点累积吸收量，结果见图2，差异结果表示为*p＜0.05，可见厄洛替尼给药组荧光素钠的累计吸收量显著高于对照组。荧光素钠是细胞旁路转运的标志物[2]，厄洛替尼可能主要通过增加小肠上皮细胞旁路通透性，从而增加荧光素钠的透过率。

图2 厄洛替尼对大鼠小肠吸收荧光素钠的影响（n=6）

2.3 单次灌胃给予厄洛替尼对头孢克洛药动学的影响

通过HPLC-UV测定得到对照组与厄洛替尼给药组大鼠体内头孢克洛的血药浓度，分别与时间作图得平均药时曲线见图3。通过药动学软件WinNonlin计算对照组与给药组头孢克洛的参数，结果见表1。单次给予大鼠厄洛替尼后，头孢克洛的t1/2、V、CL有降低的趋势，而Tmax、Cmax、AUClast有增加的趋势，Cmax、AUClas是反映吸收的重要药动学参数，虽采用SPSS统计软件进行分析，显示两组的差异无统计学意义，但加大厄洛替尼的给药剂量有可能导致吸收显著增加。