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Slc26a9基因在胃癌发生发展中的作用研究

2019-11-07岳春燕刘雪梅江仁军

川北医学院学报 2019年5期
关键词:基因型位点胃癌

岳春燕,刘雪梅,江仁军

(1.宣汉县人民医院消化内科,四川 宣汉 636150;2.遵义医学院附属医院消化内科,贵州 遵义 563000)

目前,在全世界范围内,我国胃癌发生率占据了较高的水平。在不同种类恶性肿瘤中,胃癌发病率每年新增数量达到了17%左右,死亡率达20%以上。早期诊断和治疗是提高胃癌生存率有效的方法[1]。从大量临床实验数据中显示,基因突变与基因表达是恶性肿瘤发生发展的主要因素。从以往研究工作中得出,Slc26a9基因在胃癌组织当中存在着异常表达[2]。为了进一步明确Slc26a9基因对于细胞增殖与胃癌等肿瘤疾病的发生发展所产生的影响,此次研究工作将该基因作为目的基因使用免疫组化、组织芯片以及细胞功能学实验等多种研究方式,对其临床意义与作用机制进行验证和分析。

1 资料与方法

1.1 一般资料

从在本院接受胃癌手术的患者机体中取新鲜手术标本进行研究。在配对组织选择中,从癌块中取出癌组织。正常黏膜组织从距离癌块5 cm以外的位置选取。当标本从患者本体上取出30 min后取材,并迅速放置到液氮当中进行冷冻处理,冰箱的温度控制在-80 ℃。使用冰冻切片的方式,对癌细胞的丰富程度进行观察[3]。将切片中癌细胞含量超过85%的病例纳入到此次研究工作当中[4-5]。经过最终统计得出,此次芯片分析组织的样本来自于200对组织标本,其中男性为100例,女性也为100例。患者平均年龄为(51.47±2.55)岁。另外,收集200对标本用作实时PCR与West Blot验证,男性和女性均为100例。平均年龄为(51.33±2.15)岁。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 资料收集 研究工作开展中,对研究对象的一般临床资料进行收集和整理,包括患者的性别、年龄。在完成之后纳入初步验证差异表达基因筛选[6]。根据基因芯片研究所得出的结果,选择没有出现胃癌相应研究的8个基因组织进行初步验证[7]。所有的细胞株均按照各自的培养条件,在超净工作台下完成培养[8]。在此过程中,要由实验室技术人员协助完成操作,细胞的背景资料和培养条件主要分为以下几个方面:(1)SNU-5细胞。此种上皮细胞具有悬浮和多细胞聚集生长的特征。该细胞最初从一位33岁亚洲女性的胃癌转移腹水当中分离得出,表面的表达为TAG72与CEA。需要含有20%小牛血清、100 μg/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的RPMI-1640培养液当中进行常温培养。温度控制在37 ℃,培养环境当中二氧化碳浓度为5%。(2)HGC-27细胞培养。该细胞为上皮细胞,形态为多边形。细胞来自HIC证实表明未分化胃癌转移性淋巴结当中分离得出。需要含有20%小牛血清、100 μg/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的RPMI-1640培养液当中进行常温培养。温度控制在37 ℃,培养环境当中二氧化碳浓度为5%。每2~3 d更换1次培养液,扩增时间控制在17 h。

1.2.2 Slc26a9基因多形态分析 使用无菌方法对患者取静脉血,1 mL至2 mL。使用酚氯仿抽提乙醇沉淀的方法,提取出基因组DNA,将DNA作为模板,可利用引物F1和R1当行含有SNP片段,完成扩增。当PCR总反应体为25 μL时,含有10倍PCR反应缓冲液2.5 μL的10 μmol/L的dNTP混合液1 μL。分别取5 μL扩增产物,利用内切酶Hind识别方法和识别位点GANTC完成酶切。最后,使用浓度为3%的琼脂糖凝胶电泳进行分析。

1.3 观察指标

(1)分析Slc26a9基因在胃癌中的表达率;(2)分析Slc26a9基因SNP位点基因型确定于分布频率;(3)分析Slc26a9基因不同基因型的临床指标,具体包括LYM、CRP、IgE、EU和EOS。

1.4 统计学分析

采用SPSS24.0软件处理数据,计数采用χ2检验,以[n(%)]表示。P<0.05为数据差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Slc26a9基因在胃癌中的表达

使用免疫组化方法对胃癌和癌旁组织进行了检查,得出了Slc26a9基因蛋白表达产物在人体内的表达状况。结果显示,Slc26a9基因在胃癌组织中呈现出染色包浆阳性细胞,呈现出片状或者弥漫分布的状况,阳性率为56.5%。高中分化中强度的阳性表达较为常见。在正常的组织当中,Slc26a9基因表达较为微弱,基本上处于检测不出的状况。少量阳性细胞呈现出了点片状分布状况或者散点分布状况,染色轻度较比癌组织更弱[9]。研究还显示出,患者的年龄、性别以及肿瘤位置和大小结构等,均会在不同程度上产生不同的影响。不同病理参数会影响到Slc26a9基因的蛋白表达。当患者的年龄超过了60岁时,淋巴转移、病理分期、肿瘤分化与PCNA表达均显示出差异,P<0.05。见表1。

表1 观察组Slc26a9基因在胃癌中病理参数对照表[n(%)]

2.2 Slc26a9基因SNP位点基因型确定与分布频率

使用Hardy-Weinberg遗传平衡定律进行检验,可以得出Slc26a9基因符合该定律,表明此次研究工作中所选取的基因型具有群体代表性。患者的Slc26a9基因SNP位点呈现出了3种不同的基因型[10]。分布差异有显著的统计学意义(χ2=6.340,P=0.042)。患者AA基因型比较高。在隐性模式下,对患者的Slc26a9基因进行分析得出差异同样有统计学意义(χ2=4.840,P=0.028),但在显性模式下,差异不明显,无统计学意义(χ2=3.700,P=0.055)。总体差异明显,存在统计学意义(P<0.05)。在将胃癌患者Slc26a9基因与对照组进行对比分析中,得出了两组患者基因SNP位点3种不同基因型分布存在统计学意义(P<0.05),且等位基因频率的差异存在统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 两组患者SNP位点基因型确定与分布频率对照表[n(%)]

2.3 Slc26a9基因不同基因型的临床指标对比分析

胃癌在临床上的表现具有较高的异质性,患者在诊断中,多伴有嗜酸性粒细胞比例上升的情况[11]。患者SNP位点不同基因型的特征指标均有差异,但无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 观察组Slc26a9基因不同基因型的临床指标对照表[n(%)]

3 讨论

此研究工作采用了人类全基因组芯片,对患者胃癌组织与正常组织之间的差异基因表达图谱进行了分析,发掘出不同与胃癌有关的基因,其中Slc26a9基因影响最为显著,对于胃癌发生和发展均有促进作用。除此之外,此研究还使用了细胞系与组织表达谱,研究显示,8株常见癌细胞系均在不同程度上含有Slc26a9基因表达。在胃癌组织当中,Slc26a9基因表达水平更高,并且高于正常胃粘膜组织。进一步验证了基因芯片结果的可靠性。根据肿瘤体积的亚组分析可以得出,Slc26a9基因表达和肿瘤大小有着直接关系,肿瘤大小越大,则表达越高。使用免疫组化方法对胃癌组织当中Slc26a9基因进行检测,并作出蛋白表达,此表达在正常组织当中十分微弱甚至无法检测。但对于高、中、低分化胃癌组织中显著表达,阳性表达率为56.5%。进一步结合胃癌临床特征与病理特征可分析出,Slc26a9基因阳性表达和年龄、病理分期、肿瘤分化、PCNA和淋巴结转移有着显著联系。

本研究可看出,Slc26a9基因对氨基酸转运会产生影响,进而作用于肿瘤细胞增殖中。肿瘤发生发展对营养和氧气均有着较高要求,在胃癌细胞代谢活动与细胞增殖中,均与Slc26a9基因的表达量升高有关系。研究还显示出,特异性抑制肿瘤细胞,Slc26a9基因活性抑制了正常细胞的生长与增殖,但不会对肿瘤细胞产生抑制作用,肿瘤细胞的合成速率未受到限制。因此,在临床治疗中,通过抑制肿瘤细胞中氨基酸转运载体的活性,并阻断氨基酸转运,能达到抑制癌细胞快速生长与增值的效果,进而实现合理抗癌的目的[12-13]。

组织芯片技术在我国科学研究工作中,可单独使用或者能与基因芯片技术进行配合使用。此种方式在实际应用中,能有效地完成mRNA转录、基因扩增以及基因编码产物检测分析等多项工作。该项技术在实际应用中,具有显著的经济、快速和规模性优势特征,能有效地完成基因检测。在肿瘤学病理诊断研究工作中,有着十分广泛应用空间,并存在广阔应用前景。胃癌作为一种严重肿瘤疾病,在常见恶性肿瘤中排列第四位。在致死恶性肿瘤疾病中位列第二。在临床上为胃癌患者提供根治性手术,在手术后5年之内生存率能达到50%左右。从分子水平认知的角度对胃癌发生和发展进行分析,寻找胃癌的特征性标志物,是目前临床上对胃癌疾病进行诊断和治疗的有效途径。随着我国医疗卫生领域的持续发展和进步,目前,我国已经建立了大规模的中国胃癌人群组织芯片,为今后的胃癌机制与基因图谱研究工作,搭建了良好的平台[14]。本文采用免疫组织化学染色方式对Slc26a9基因进行检测,明确蛋白产物在胃癌和正常组织当中存在的表达差异,有利于为后续进一步研究Slc26a9基因,以及Slc26a9基因对其他恶性肿瘤疾病发生发展所产生的影响进行分析。此次研究使用组织芯片技术均按照统一的选材标准,放置在同一张切片上。通过高通量原位分析的方式,确保了资源、时间、空间等数据指标一致。提高了实验结果的可靠性。

综上所述,Slc26a9基因在胃癌发生发展中有显著上调的作用,病理组织检测得出,该基因组织负责转运的几种氨基酸水平,在患者体内均明显升高,表明此种基因会影响到患者细胞增殖,参与到肿瘤发生发展机制中,产生促进癌变作用。

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