大鼠口腔常在菌的分离培养与鉴定

秦 臻 李正淼 秦 汉 姜亨波 陈 微 石运芝

1.口腔医学院； 2.动脉粥样硬化研究所，山东第一医科大学(山东省医学科学院)，山东 泰安 271016

牙菌斑(dental plaque)是在所有人口腔中都存在的一种由口腔微生物群落组成的生物膜结构[1]。人类口腔中存在着结构复杂的微生物菌群，它们在宿主口腔健康状况方面起着重要作用。口腔疾病(如龋齿，牙龈炎，牙周炎等)是由于牙菌斑中的微生物之间以及微生物与宿主之间的生态平衡被打破而发展成的。了解口腔牙菌斑中微生物的种类对恢复口腔内生态平衡，治疗与预防口腔疾病有重大意义[2-3]。口腔疾病的研究大多要建立动物模型才能进行，由于动物与人类的口腔始终存在一定的差别以及口腔疾病致病机制的复杂性，很难确定一个完美的动物模型来完全模拟人类口腔疾病的发生发展规律。而且由于不同实验动物的差别，所建造的动物模型中牙菌斑的微生物组成会有差别，这些都会对实验结果造成影响[4]。有研究表明，小型猪、大鼠、人类口腔内微生物构成比之间存在差异[5]。因此，在进行口腔疾病相关研究之前，研究者不仅要熟悉人类口腔牙菌斑中微生物种类，更要明确实验动物口腔牙菌斑中微生物种类。通过分离、培养、鉴定实验动物口腔牙菌斑中微生物种类，与人类作对比，可以对有关口腔疾病防治的相关研究提出更准确的意见与建议。相比其他动物，鼠科的动物较温顺，饲养成本和生长所需空间小，并且有大量学者采用鼠科动物进行口腔相关疾病的研究，曾有研究者在仓鼠口内提取到双歧杆菌[6]。所以此次实验我们主要在健康成年Wistar雄性大鼠口内建立菌斑模型，对其牙菌斑细菌进行分离培养与鉴定，为选择适合人类口腔微生物和疾病研究的模型动物，建立实验动物菌斑模型、龋病模型，研究龋病防治方法等提供基础性资料。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康成年Wistar雄性大鼠24只，质量(220±20)g，购自济南朋悦公司，常规饲养，通风清洁，光照12 h，适应1周后开始实验。

1.2 实验试剂

脑心浸出液肉汤(brain heart infusion broth，BHI；青岛高科园海博生物技术有限公司)、哥伦比亚血琼脂培养基(济南百博生物技术股份有限公司)、MSA培养基(青岛高科园海博生物技术有限公司)、TPY琼脂培养基(青岛高科园海博生物技术有限公司)、菌斑染色剂-碱性品红(日进齿科材料有限公司)、结晶紫染液、碘液、95%酒精、稀释复红、香柏油、Trans2K DNA Marker、Mix、上游与下游引物(表1)、ddH2O、BIOWEST REGULAR AGAROSE G-10(上海微科生物技术有限公司)、50×TAE缓冲液(北京索莱宝科技有限公司)、核酸凝胶染料试剂gelred(北京索莱宝科技有限公司)和琼脂糖等。

表1 上下游引物

1.3 实验步骤

1.3.1菌斑模型的建立

用普通颗粒饲料和60%高糖水饲喂健康成年Wistar雄性大鼠。20天后，用菌斑染色剂检测大鼠磨牙舌面与牙合面菌斑的形成情况。

1.3.2牙菌斑的采集与细菌的分离鉴定

用无菌棉棒在牙合面窝沟点隙采集牙菌斑，涂布在MSA培养基与TPY琼脂培养基上，37℃ 恒温箱(天津泰斯特仪器有限公司101-3AB型)中培养48 h，观察菌落形态。

用接种环分别挑取MSA培养基与TPY琼脂培养基中的优势菌落，接种在哥伦比亚血琼脂培养基(以下称血琼脂培养基)上进行纯培养，37℃恒温箱培养48 h，观察菌落形态。随后将血琼脂培养基上的菌落接种于脑心浸出液肉汤(以下称BHI增菌液)，37℃BS-1E恒温震荡培养箱(常州市金坛友联仪器研究所)中增菌48 h。

1.3.3革兰氏染色

在洁净的玻片中间加生理盐水1滴。接种环烧灼灭菌后，取血琼脂培养基中细菌培养物与生理盐水混匀，涂成直径1 cm的均匀薄膜涂片。然后按照顺序滴加结晶紫染液、革兰碘液、95%酒精、稀释复红染液，每两个步骤之间需用水冲洗玻片。最后晾干，滴加香柏油，用油镜观察细菌形态。烧去接种环上多余的菌体后，再取另一细菌培养物重复上述步骤[8]。

1.3.416S rRNA基因扩增和测序

取增菌液500 μL加入离心管内，12 000 r/min离心1 min，弃去上清液；加入500 μL dd H2O洗涤2次，离心后弃掉上清液。随后离心管内加入40 μL dd H2O，混匀，98℃水浴加热30 min，冷却，瞬时离心，上清液中即含细菌DNA，可用于16S rRNA基因扩增。

PCR扩增的总反应体积为25 μL，依次加入Mix 12.5 μL，dd H2O 10.5 μL，DNA提取液1 μL，引物27F 0.5 μL，引物1492R 0.5 μL，瞬时离心混匀。在Applied BiosystemsTMVeritiTM96-Well Thermal Cycler 热循环仪中，反应按95℃预变性5 min，95℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸90 s，循环30次，最后72℃延伸10 min[9]。

将扩增产物一部分在DYY-6D电泳仪(北京市六一仪器厂)中进行1%琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像仪(BIO RAD UNIVERSAL HOOD)观察，拍照，记录结果；另一部分送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。测序结果在GenBank数据库中使用BLAST软件进行序列比对分析。16S rRNA序列同源性大于99%提示属于同一种细菌。

1.4 统计学方法

所有数据均采用均数±标准差表示，应用SPSS15.0统计软件，对所得数据进行统计分析，以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 牙菌斑形成情况

在大鼠磨牙牙合 面窝沟内可见指示剂着色，表明此处有菌斑形成,见图1。

图1 大鼠牙合面菌斑染色结果

2.2 细菌在不同培养基上的生长情况

在血琼脂、BHI和MSA培养基中共分离得到3种不同菌落形态的细菌，分别标记为1、2和3号。

1号细菌在血琼脂培养基、BHI培养基与MSA培养基上呈完整的乳膏样或白色的圆形菌落，面积较大，表面光滑湿润，边缘整齐，见图2(A)、(D)、(G)。细菌在血琼脂培养基中不溶血且生长情况最好，BHI培养基和MSA培养基的菌落直径明显小于血琼脂培养基，BHI培养基的菌落直径明显小于MSA培养基,差异均具有统计学意义(P<0.05)，见表2。

2号细菌在BHI与MSA培养基上呈半透明状，是圆形突起、表面粗糙、边缘整齐的针尖样大小菌落，见图2(E)、(H)；在血琼脂培养基中为直径1 mm大小半透明状菌落，不溶血且生长情况最好，见图2(B)。菌落直径统计结果显示，BHI培养基和MSA培养基的菌落直径明显小于血琼脂培养基，且差异具有统计学意义(P<0.05)，见表2。

3号细菌在血琼脂培养基与BHI培养基上表现为直径1～2 mm的圆形灰白色菌落，表面光滑湿润，边缘整齐，见图2(C)、(F)；在MSA培养基上，呈直径3～4 mm的半透明状菌落，生长情况最好，见图2(I)。菌落直径统计结果显示，血琼脂培养基和BHI培养基的菌落直径明显小于MSA培养基，BHI培养基的菌落直径明显小于血琼脂培养基，且差异具有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 细菌在不同培养基上的菌落直径(mm)

注：同一列中上标不同小写字母表示差异有统计学意义，P<0.05。

A.血琼脂培养基上1号细菌生长情况；B.血琼脂培养基上2号细菌生长情况；C.血琼脂培养基上3号细菌生长情况；D.BHI培养基上1号细菌生长情况；E.BHI培养基上2号细菌生长情况；F.BHI培养基上3号细菌生长情况；G.MSA培养基上1号菌落生长情况；H.MSA培养基上2号菌落生长情况；I.MSA培养基上3号菌落生长情况

图2 细菌在不同培养基上的生长情况

2.3 革兰氏染色结果

革兰氏染色结果显示3种细菌染色后都为紫色，提示它们都为革兰氏阳性菌。1号细菌为圆形或椭圆形，成对或短链式生长，见图3(A)。2号细菌呈细长杆状，中等大小，多数单个分布，少数成对分布,见图3(B)。3号细菌为圆形或椭圆形，链状排列，长短不一,见图3(C)。

A.1号细菌；B.2号细菌；C.3号细菌

2.4 16S rRNA基因扩增和测序

16S rRNA基因扩增显示3种细菌都出现了1500 bp左右的目标条带，无杂带，特异性较好。1号细菌亮度最大，其次是3号细菌，2号细菌亮度较淡，见图4。

序列比对结果显示1号细菌为粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)，2号细菌为发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)，3号细菌为唾液链球菌(Streptococcussalivarius)。

图4 3种细菌产物凝胶电泳图

3 讨 论

本实验成功建立了菌斑模型，见图1。从中分离到粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)，发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)和唾液链球菌(Streptococcussalivarius)。大量的研究显示这3种细菌同时存在于人类口腔中[10]。这3种细菌都属于厚壁菌门(Firmicutes)、芽胞杆菌纲(Bacillales)、乳杆菌目(Lactobacillales)。粪肠球菌属于肠球菌科(Enterococcaceae)、肠球菌属(Enterococcus)，在难治性根尖周炎中，粪肠球菌的检出率高达77%[11]，一般以单一感染为主[12]。本实验中，大鼠的牙菌斑中检测出粪肠球菌为主要优势菌之一。大多数根尖周炎继发于牙髓疾病，而牙髓疾病是由于龋病、外伤等波及牙本质深层，刺激通过牙本质小管传入牙髓，引起牙髓组织炎症或修复反应[13]。究其源头有一部分是由于龋病引起难治性根尖周炎，而上世纪50年代Orland和Fifzgerald 等就认识到，龋病无菌斑不成立[14]，菌斑中的粪肠球菌会通过牙本质小管进入牙髓，继而到达根尖孔，接触到血管、淋巴组织等。这种途径进入的粪肠球菌甚至会引起菌血症，随着血液组织到达脏器，从而引起或加速脏器的病变。发酵乳杆菌属于乳杆菌科(Lactobacillaceae)、乳杆菌属(Lactobacillus)，发酵乳杆菌是口腔内的正常菌群，该菌可以发酵多种糖，具有较强的产酸耐酸能力，在龋洞与牙菌斑中常见，只是数量少，黏附能力较弱。发酵乳杆菌是否能致龋存在着不同的看法，它在龋损的产生中不如在龋损的发展中起到的作用大，在龋损的发展中它本身的数量会增加，并且可以促进损坏速度以及病变区其他致龋菌的黏附能力。唾液链球菌属于链球菌科(Streptocpccaceae)、链球菌属(Streptocpccus)。唾液链球菌在健康人体口腔中占重要地位，它可利用蔗糖合成水溶性果聚糖从而致龋。曾有实验证实此菌种可对动物致龋，对人类却无致龋性[15]。唾液链球菌对人体而言是一种益生菌，可以抑制多种微生物的活性，减少有害菌群在口腔和呼吸道的定植。唾液链球菌对口臭、口腔念珠菌病、中耳炎等的预防和治疗有良好的效果。虽然Wistar大鼠与人类口腔组成相似，但也有研究表明，Wistar大鼠与人类口腔菌群结构门水平、属水平各不相同，在菌群丰富度与相似程度上也不相同[16]。本实验在Wistar大鼠的喂养食物与时间、性别、菌斑获取牙位等方面与上述研究可能不同，使得实验结果不一致。

综上所述，本次实验在Wistar大鼠建立了菌斑模型，分离出了3种细菌，且Wistar大鼠产生龋病，提示它们可能对龋病的发生发展起到一定程度的作用，在人体中，可能也会有相似的作用。这可以为建立实验动物菌斑模型、龋病模型，研究龋病防治方法等提供基础性资料。Wistar大鼠的口腔牙菌斑微生物组成与人类相似，提示该模型动物可以为口腔微生物和口腔疾病的研究提供参考。