甘蔗亚硫酸法养茎杂交影响因素分析

雷敬超， 周 会， 高丽花， 杨翠芳， 周 珊， 张保青， 王泽平， 杨荣仲， 李 翔， 高轶静

(1.广西农业科学院甘蔗研究所/广西甘蔗遗传改良重点实验室/ 农业农村部广西甘蔗生物技术与遗传改良重点实验室， 南宁 530007)

目前，通过选配甘蔗亲本进行授粉杂交仍是甘蔗育种的主要方式，而甘蔗亚硫酸法养茎杂交是保证在一定时间内蔗茎进行新陈代谢、完成开花结实的一项重要技术。该方法节省大量人力，不浪费花穗，特别是错过包茎时间的亲本，而且便于集中管理，杂交效果好，大大提高了花穗的生产效率。因此，研究该方法养茎杂交过程中穗茎节数和溶液更换周期对开花结实的影响，可为甘蔗亚硫酸法养茎杂交中开花亲本的保存、生长提供参考依据。甘蔗亚硫酸养茎杂交法最早由美国的Verret等[1]提出，然后经由各国甘蔗育种工作者不断改进并利用。在我国，最早由海南甘蔗育种场的陈西文[2]对亚硫酸法的水质、配方、杂交期间的温度和湿度进行了研究，之后，云南农科院甘蔗所的王丽萍[3]对传统的高压包茎法和亚硫酸养茎法进行了比较，陈玉水等[4-5]在描述台湾糖业研究所对甘蔗种子发芽力影响因素的研究中，也应用高压包茎法和亚硫酸养茎法进行了比较。研究结果均表明，甘蔗亚硫酸养茎杂交能提高种子的饱满度和有效花穗率，值得进一步研究利用。甘蔗亚硫酸法作为甘蔗开花杂交的一项重要技术，除了配方的改良、杂交期间的温度和湿度外，对该方法的其它影响因素研究未见相关报道。因此，本研究选取2个易开花的优良亲本作为试验材料，试验地点设在中国农业科学院甘蔗研究中心海南甘蔗杂交基地，设置不同的穗茎节数和亚硫酸溶液养茎更换周期，对各处理的自交发芽率进行统计分析。确定最佳的穗茎节数和亚硫酸溶液更换周期，以期在甘蔗选育种的杂交过程中应用亚硫酸法为开花亲本的保存、生长提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试的2份甘蔗亲本为易开花的优良亲本桂糖44号和云野06-9。其中桂糖44号(桂糖的英文代码用GT表示)为广西壮族自治区农业科学院甘蔗研究所选育，桂糖系列品种均具有早熟、高糖、丰产、宿根性好的特点[6-8]；云野06-9是割手密BC4材料(云野的英文代码用YunY表示)，主要具有早熟的特点，为云南省农业科学院甘蔗研究所惠赠。试验地点设在中国农业科学院甘蔗研究中心海南甘蔗杂交基地，砍取甘蔗穗茎的时间为2018年11月23日。

1.2 试验方法

1.2.1试验设计

2个开花亲本的穗茎节数分别选取15节、20节、25节(穗茎节数从花穗下第1片叶开始计算，第15叶位对应的节定义为第15节)，各设置3 d、5 d、7 d的亚硫酸溶液养茎更换周期，每个处理3次重复。每个处理分别置于亚硫酸溶液中养茎自交，40 d后对收集各处理的种子进行发芽试验，统计各处理的克平均发芽数。

1.2.2抽穗率调查

记录供试亲本的开花株数和总有效株数，统计供试亲本抽穗率，抽穗率(%)=(抽穗株数/总株数)×100%。

1.2.3花粉染色率测定

花粉染色率的测定采用碘-碘化钾染色法[8]。在显微镜下观察视野中，呈球形且被染成蓝褐色的花粉粒为可能具有活性的花粉，而呈三角形或皱缩且未被染色或染色很浅的花粉粒则为未发育或发育不全的无活性花粉。花粉量和染色率采用3位数数值表示方法，该方法从澳大利亚甘蔗产业研究所(SugarResearchAustralia，SRA)引进：估算观察视野中花粉量占总视野面积的比例，比例低于50%时百位数用1表示，超过50%时百位数用2表示；十位和个位数表示花粉染色率。染色率(%)=(视野中被染色的花粉粒数/视野中总花粉粒数)×100%。

1.2.4亚硫酸法养茎杂交

选择开花长势一致的抽穗茎，从根部截断，剪除大部分叶片，运回温室，按试验设计的节数，快速切去穗茎下端节间组织，迅速插入盛有18 L亚硫酸溶液的桶中。每日08：00时和10：00时进行人工授粉，摇动花穗，使花粉飘落至花穗上，人工授粉过程持续7 d。杂交温室内控制温度在25～28 ℃，相对湿度在60%～85%。亚硫酸养茎溶液配方为每升水溶液含：亚硫酸(以SO2计)154.5 mg，硫酸39.1 mg，硝酸54.6 mg，磷酸89.8 mg。

1.2.5发芽试验

杂交完毕15 d左右，用特制沙袋套住整个花穗，下端扎紧；35 d后，剪下花穗，放入烘干房间(温度11 ℃，湿度13%)进行干燥处理4 d，然后脱粒，装入防水纸袋中。称取约0.5 g，每个处理3次重复，置于铺有滤纸的培养皿中，平铺种子，喷水，湿润种子和滤纸，再放置于光照培养箱(32 ℃，12 h暗期，12 h光照)中培养5 d，然后统计发芽数量。克平均发芽数=种子发芽数/种子重量(g)。

1.3 数据分析

应用R语言ggplot 2软件包进行差异显著性分析，应用Microsoft Excel软件作图。

2 结果与分析

2.1 甘蔗亲本的开花习性

桂糖44号和云野06-9的抽穗率分别为40%和50%，均属易开花亲本，可为该试验设计的多个处理提供足够的穗茎(表1)。桂糖44号和云野06-9的花粉量和花粉染色率均为255%，说明该2个亲本花粉量中等(百位数为2)，染色率约为55%，保证了供试材料进行自交的花粉量和花粉活性(表1，图1，图2)。

表1 甘蔗亲本的开花习性

亲本抽穗率/%花粉量及平均染色率/%开花特点桂糖44号40255先抽后开云野06-950255边抽边开

注：用3位数数值组合来表示花粉量和染色率，百位数代表花粉量，1表示少，2表示多；十位和个位数以百分数形式表示染色率。

图1 桂糖44号花粉镜检观察

图2 云野06-9花粉镜检观察

2.2 穗茎节数和溶液更换周期对亚硫酸法养茎杂交的影响

差异显著性分析表明，穗茎节数和亚硫酸溶液养茎更换周期对亲本开花结实的影响没有显著差异。在本试验中，穗茎节数为15节时，2个亲本的克平均发芽数均随着亚硫酸溶液更换周期天数的增加而增加，并且在更换周期为7 d时的克平均发芽数为所有组合处理中最高；穗茎节数为20节时，桂糖44号在各个亚硫酸溶液更换周期组合处理中的克平均发芽数无明显差异，云野06-9在亚硫酸溶液更换周期为5 d的组合处理中克平均发芽数最低；穗茎节数为25节时，桂糖44号在亚硫酸溶液更换周期为5 d的组合处理中克平均发芽数最低，云野06-9在各个亚硫酸溶液更换周期组合处理中的克平均发芽数无明显差异(图3)。

图3 穗茎节数和亚硫酸溶液更换周期对 亲本养茎杂交的影响

3 讨 论

本研究选择的2个亲本花粉量和染色率都较高，然而自交后的克平均发芽数都较低(不超过30)，这与前人所述的甘蔗自交结实率很低[9]的结果一致，但是整体偏低的发芽数数据导致各处理间的差异幅度不能更大程度地显现。在后续的甘蔗亚硫酸法养茎杂交影响因素试验中，可考虑用供试亲本作为父本与同一个母本杂交，提高结实率。

亚硫酸溶液养茎杂交的原理是亚硫酸溶液中的二氧化硫作为防腐剂，不仅可抑制微生物的生长，还具有还原作用，可防止主体被氧化。本研究的亚硫酸溶液更换周期从3 d至7 d均未对亲本的开花结实具有显著影响，说明在本试验条件下(温度25～28 ℃，湿度60%～85%)，即使亚硫酸溶液中的二氧化硫有所挥发，但其初始浓度(154.5 mg·L-1)足够维持亲本在7 d内的生长。

本研究结果显示，穗茎节数和亚硫酸溶液养茎更换周期对亲本开花结实的影响没有显著差异，并且穗茎节数为15节、亚硫酸溶液养茎更换周期为7 d的组合处理的发芽效果最好，说明不仅在砍取穗茎时可选择较短的长度(15节)，为穗茎的运输带来便利，并且在养茎杂交过程中也不需要频繁更换溶液，节约了人工和成本。

4 结 论

穗茎节数和亚硫酸溶液养茎更换周期对亲本开花结实的影响没有显著差异，在砍取穗茎时可选择较短的长度，在养茎杂交过程中也不需要频繁更换溶液，节约了人工和成本。