超声造影时间-强度曲线与乳腺癌血管生成拟态生成及区域分布的相关性分析

樊 静 ，蒋晓春 ，史点顺 ，洪建军 ，汤晓晴 ，王 蓓

（1浙江省义乌復元私立医院超声医学科 浙江 义乌 322000）

（2浙江省中医院乳腺中心 浙江 杭州 310000）

血管生成是肿瘤发生发展得重要机制之一，其中血管生成拟态（vasculogenic mimicry，VM）是不依赖于内皮细胞的新肿瘤供血模式，是肿瘤细胞模仿机体血管内皮细胞血管生成并通过自身基因型反转变形和细胞外基质重塑形成瘤细胞条索样微循环管道，为肿瘤细胞提供血液供应[1]。学者们常通过免疫组化及特殊染色的方式进行标记，新生血管管壁由CD31或CD34等内皮细胞标记物染色阳性的血管内皮细胞和PAS染色阳性的基底膜构成，而VM结构是由CD31或CD34等内皮细胞标记物染色阴性的肿瘤细胞和PAS染色阳性的基底膜构成[2]。目前在黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌等恶性肿瘤中等多种组织中均发现VM的存在，且其存在与患者预后密切相关[4]。目前关于超声造影（Contrast enhanced ultrasound，CEUS）与VM 阳性乳腺浸润性导管癌相关性的研究比较少[4]，本研究拟通过进行CEUS时间-强度曲线（time intensity curve， TIC）观察VM阳性乳腺浸润性导管癌中央区、边缘区特征，从而探讨CEUS与肿瘤VM生成及区域分布的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取浙江省义乌復元私立医院和浙江省中医院2016年1月—2018年12月经手术病理证实为乳腺浸润性导管癌患者167例（167个病灶），均为女性，年龄（28～72）岁，平均（56.2±10.3）岁。所有患者手术前均行常规超声及CEUS检查，检查前未行穿刺活检及任何临床治疗。纳入标准：①肿块样病灶；②病灶＜4cm；③均获得手术病理。排除标准：①非肿块样病灶；②病灶≥4cm；③失访患者。所有患者CEUS检查前签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 常规超声检查 采用esaote MyLabClassC彩色多普勒超声诊断仪，LA532变频线阵探头频率为10～13MHz。患者取仰卧位，充分暴露双侧乳腺，在常规超声下观察病灶位置、大小、数目、回声及血流特征，并根据血流分布选择病灶的最佳切面，选定图片切面尽量包括病灶及其周围正常乳腺组织。

1.2.2 CEUS检查 采用esaote MyLabClassC彩色多普勒超声诊断仪系统自带软件超声造影匹配成像技术（contrast-tuned imaging，CnTI）。固定探头位置不变切换到CEUS模式，造影参数设置恒定。造影剂采用Bracco公司超声造影剂SonoVue（Bracco，Italy）。使用前注入生理盐水5ml，振荡摇匀，配制成微泡悬浊液（浓度5mg/ml）。经肘静脉团注5ml后计时，随即团注入5ml生理盐水，记录造影全过程并存盘。整个造影全过程约3分钟。

1.2.3 CEUS图像区域界定 由两位有5年经验超声医生在未知患者临床资料情况下复习所存贮图像，并将病灶的不同区域划分为：①中央区：病灶中央部位直径约1cm的区域，若病灶较小可适当缩小取样框。②边缘区：以超声造影后病灶增强范围的边界为外界的区域，取样尽量避开肿瘤滋养血管。③病灶旁乳腺正常组织：正常乳腺腺体组织。所有区域ROI面积相近，取样框尽量处于同一屏幕及深度，见图1。用美兰标记肿块的研究切面，在边缘带的取样区域留下美兰，并且在研究切面的皮肤层划线。

图1：VM阴性乳腺浸润性导管癌患者（a）CEUS（b）TIC。VM阳性乳腺浸润性导管癌患者（c）CEUS和（d）TIC。

1.2.4 CEUS图像分析 利用QontraXt软件行定量分析。描记ROI后，生成灌注参数立体三维图像及灌注曲线。每个ROI记录参数包括：始增时间（initial time，IT）、峰值强度（peak intensity，PI）、达峰时间（peak time，PT）、上升斜率（rising slope，RS）[（峰值强度-始增强度）/（峰值时间-始增时间）]、消除斜率（descending slope，DS）[（峰值强度-始增强度）/（平均渡越时间-峰值时间）]、平均渡越时间（mean transit time，MTT）、曲线下面积（area under curve，AUC）。

表1 单纯DCIS组与浸润性癌组患者临床病理特征比较

表2 VM阳性组造影参数（±s）

表2 VM阳性组造影参数（±s）

53 0.60±0.25 50.67±23.63 0.02±0.01 1.82±1.13 48.56±12.48 2642.55±136.63中心区 18.02±6.93 0.56±0.28 53.79±24.52 0.02±0.01 1.73±1.02 47.83±12.57 2503.53±128.84病灶旁乳腺组织 20.64±5.72 0.48±0.21 58.83±27.34 0.01±0.01 1.51±0.97 43.67±11.74 2378.52±128.63 VM阳性组 IT（s） PI（dB） PT（s） RS（dB/s） DS（dB/s） MTT（s） AUC（dB/s）边缘区 15.47±8.t 11.429 4.235 12.483 3.572 6.245 3.583 23.534 P 0.024 0.368 0.001 0.249 0.074 0.534 0.000

1.2.5 乳腺癌术后病理分析 所有乳腺癌标本经4%甲醛固定，常规石蜡包埋，4μm连续切片，行分别HE染色和CD34/PAS双染色，CD34/PAS双染色步骤[5]如下：石蜡切片常规脱蜡至水后3%H2O2阻断内源性过氧化物酶，修复时选择柠檬酸微波修复方式，随后行CD34着色，再利用DAB显色，利用导致相差显微镜观察（×100）。观察中一旦发现血管内皮细胞出现着色情况，立即用流水清洗，时间至少在1min上，终止整个反应；第二步将切片浸于浓度0.5%的过碘酸溶液中，并氧化反应10～15min，接着利用流水冲洗2min；置于Schiff液中，避光环境下反应15～20min，再流水冲洗2min；偏重亚硫酸钠反应2次，1min/次；流水冲洗2次，2min/次；苏木素浅染细胞核，脱水、透明、中性树胶封片。VM的判断标准：①含有血细胞的管腔。②管腔壁细胞由CD31染色结果阴性的肿瘤细胞构成。③PAS染色结果阳性。

1.3 统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验；二分类变量和无序变量采用χ2或Fisher's确切概率法进行比较。多组间比较采用ANOVA方差进行比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床资料

所有患者超声测量肿瘤平均大小（2.74±1.03）cm。浸润性导管癌Ⅰ级70（41.92%）例，Ⅱ级57（34.13%）例，Ⅲ级40例（23.95%）。淋巴结未发生转移者82（49.10%）例，转移者85（50.90%）例。VM阳性组患者病理分级以Ⅱ、Ⅲ级为主，发生淋巴结转移更为常见，差异具有统计学意义（P＜0.05），而VM阳性和阴性组患者肿瘤大小无显著统计学差异（P＞0.05），见表1。

2.2 VM阳性和VM阴性组患者CEUS比较

CEUS TIC结果显示VM阳性组患者PI明显增高、PT显著缩短、AUC明显增大，差异具有统计学差异（P＜0.05）。两组患者在IT、RS、DS和MTT上差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

2.3 VM阳性组患者肿瘤边缘区、中央区和乳腺病灶旁组织比较

VM阳性组患者肿瘤边缘区、中央区和乳腺病灶旁组 织 IT分 别 为（15.47±8.53）s、（18.02±6.93）s、（20.64±5.72）s；PT分 别 为（50.67±23.63）s、（53.79±24.52）s、（58.83±27.34）s；AUC分 别 为（2642.55±136.63）dB/s、（2503.53±128.84）dB/s、（2378.52±128.63）dB/s，三组差异具有统计学意义（P＜0.05），其中PI、RS、DS和MTT无显著统计学差异（P＞0.05），见表2。

2.4 VM阴性组患者肿瘤边缘区、中央区和乳腺病灶旁组织比较

VM阴性组患者肿瘤边缘区、中央区和乳腺病灶旁组织 PI分 别 为（0.61±0.27）dB、（0.45±0.18）dB、（0.41±0.20）dB。AUC分别为（2642.55±136.63）dB/s、（2411.46±145.76）dB/s、（2236.67±146.88）dB/s，二组差异具有统计学意义（P＜0.05），其中IT、PT、RS、DS和MTT无显著统计学差异（P＞0.05），见表3。

表3 VM阴性组造影参数（±s）

表3 VM阴性组造影参数（±s）

72 0.61±0.27 58.59±22.68 0.01±0.01 1.55±1.46 45.34±11.52 2642.55±128.65中心区 21.24±4.62 0.45±0.18 54.25±20.53 0.01±0.01 1.48±0.89 44.42±11.07 2411.46±145.76病灶旁乳腺组织 20.78±5.45 0.41±0.20 52.67±20.83 0.01±0.01 1.35±0.92 43.26±10.85 2236.67±146.88 VM阴性组 IT（s） PI（dB） PT（s） RS（dB/s） DS（dB/s） MTT（s） AUC（dB/s）边缘区 20.67±6.t 1.035 17.235 5.768 1.214 5.458 2.558 13.548 P 0.958 0.002 0.076 0.985 0.245 0.782 0.001

3 讨论

VM属于肿瘤组织内的功能性微循环的一种，其发现源于Maniots等[6]研究葡萄膜黑色素瘤时发现直径＞1cm的瘤体中央未见血管内皮依赖的血管，以及未见坏死区域，但可见大量PAS染色阳性。后续研究发现将活性炭注入恶性黑色素瘤小鼠模型时可见活性炭颗粒分布于VM结构和内皮依赖性血管中央[7]，证实VM是肿瘤组织内的功能性微循环，该发现为VM的影像学检查提供了组织学依据。

影像学是活体状态下量化评估VM是否存在及其密度的重要方法，其可作为瘤体内微循环的评价指标之一，为术前分级、预测靶向治疗疗效及预后提供重要依据。目前研究报道采用DCE-MRI评估乳腺癌模型VM生成实验发现VM阳性组肿瘤由周边至中央呈均匀性逐渐增强，而VM阴性组肿瘤表现为中央无明显强化，该结果经病理、电镜及免疫组化证实VM阳性组瘤体中央无血管内皮样结构及明显坏死及纤维化，并可见VM血管通路[8]。而经过抗血管生成治疗后的肿瘤，DCE-MRI可发现VM阳性肿瘤治疗后其外周和中心区域的VEGF表达、VM表达与Ktrans值间均具有正相关关系[9]。研究还采用CEUS对裸鼠卵巢癌移植瘤模型研究，发现肿瘤VM密度、微血管密度与PI、MTT呈正相关[10]。故以上研究表明DCE-MRI、CEUS可检测肿瘤VM血管的存在及其密度。然而，其用于患者临床评估VM的存在及其数量尚未见报道。

本研究利用CEUS定量参数评估CEUS与VM生成及其分布的相关性，结果表明VM阳性组患者PI增加，PT延长，AUC增加，与以往卵巢癌研究一致[10]，认为VM阳性肿瘤具有更高更快的造影剂充盈特性，分析原因可能为VM管道内部很少具有微血栓形成，其通过表达血管内皮钙黏蛋白、基质金属蛋白酶等改变肿瘤细胞之间的粘附方式，影响肿瘤细胞微环境，调节凝血功能等机制有关[11]。此外，VM管道形成还受到肿瘤细胞的牵张力、细胞外基质生成等因素影响，使得VM管网状结构具有更好的血液循环功

能[12]。

此外，本研究将VM阳性及阴性病灶分别从边缘区、中央区和乳腺正常组织进行分析，结果发现VM阳性肿瘤边缘区IT和PT缩短，AUC增加，三者显著高于肿瘤中央区和乳腺正常组织，而VM阴性肿瘤则出现边缘区PI和AUC增加现象，该研究结果与MRI及病理研究结果一致[8,13,14]，认为VM更多存在于病灶边缘区，并且附近无坏死或周围炎性细胞，故其整体瘤体增强为均匀性高增强，其PI在中央区和边缘区无显著差异。反之VM阴性组瘤体周边PI高于中央区，其中央区出现出血坏死，从而导致造影剂呈充盈缺损征象。其原因可能为肿瘤细胞排列在VM通道的内表面上，这些细胞可通过分泌蛋白酶降解相邻的结缔组织并渗入血管的基底膜，直接暴露于血流从而使造影剂更易于进入肿瘤内部，并使肿瘤更容易发生血液转移到其他区域[4]。该现象反之也证明了VM阳性肿瘤具有高度恶性、可塑性和低分化的特性，而本研究结果认为乳腺癌 VM阳性肿瘤患者病理分级更高，且发生淋巴结转移的现象更为常见也揭示了VM与乳腺癌的高侵袭性、不良预后密切相关。

综上所述，VM阳性乳腺癌恶性程度更高，发生淋巴结转移更为常见。VM阳性乳腺癌PI明显增高、PT显著缩短、AUC明显增大。其中VM阳性乳腺癌边缘区CEUS TIC显示IT和PT较中央区显著缩短，AUC明显增大，而VM阴性乳腺癌边缘区PI和AUC较中央区增高。CEUS可作为VM生成和分布的有效评估方法。