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阿魏酸钠-肝素-泊洛沙姆水凝胶对脊髓损伤大鼠神经修复和再生的影响

2019-11-06赵应征俞雪锋

中国药理学通报 2019年11期
关键词:轴突胶质脊髓

蒋 曦,赵应征,俞雪锋

(1. 浙江医药高等专科学校药学院,浙江 宁波 315000;2. 浙江大学明州医院药剂科,浙江 宁波 315000;3. 温州医科大学药学院, 浙江 温州 325000)

脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是神经系统最严重创伤之一。目前,已有很多促进受损脊髓的修复策略,其中损伤处神经的再生与修复尤为重要[1]。脊髓在损伤后具备轴突再生潜力,而损伤的轴突能否再生与其内在因素和局部微环境均有关[2]。研究表明,多酚类化合物阿魏酸钠(sodium ferulate,SF),可改善SCI引起的运动功能障碍[3],且其机制涉及神经保护与神经再生作用。但SF需长期大剂量给药才能达到疗效,原因在于口服给药不易透过血-脊髓屏障,导致其在应用时出现瓶颈。近年来,人工合成高分子支架材料是目前治疗SCI的研究热点之一。

本实验通过建立SCI动物模型,以原位注射方式进行分组给药。通过观察各组大鼠的运动能力变化,比较SF溶液与SF肝素-泊洛沙姆(heparin-poloxamer hydrogels,HP)水凝胶制剂的疗效,深入研究神经修复相关蛋白(GAP43、GFAP、Nestin)的表达,进一步探讨SF作用机制。通过生物素葡聚糖胺(biotin dextran amine,BDA)示踪法,论证SF-HP水凝胶制剂的疗效。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 ♂成年SD大鼠,体质量(200±20)g,购于温州医科大学实验动物中心,实验动物许可证号:SCXK(浙)2015-0001。动物自由进食、饮水。本实验涉及的动物实验符合1986年欧洲共同体理事会指导,并通过温州医科大学动物护理和使用委员会批准。

1.1.2试剂 SF购于Sigma;胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)抗体(sc-33673)、生长相关蛋白(growth associated protein-43,GAP43)抗体(sc-33705)、Nestin抗体(sc-23927),购于Santa Cruz;BCA试剂盒(P0012),购于上海碧云天生物技术有限公司。

1.1.3仪器 Avanti-20XP型离心机(Beckman-Coulter);IX70型倒置显微镜(日本Olympus);WDT-V型脑立体定向仪(西安西北光电医疗器械厂);电泳与转膜设备、酶标仪(Bio-Rad);GL-20C高速离心机(Thermo);BMJ-Ⅲ型组织包埋机(常州中威电子仪器有限公司);石蜡切片机(英国珊顿公司);黏度计DV-I Prime(BROOKFIELD)。

1.2 方法

1.2.1SF-HP温敏性水凝胶的制备 以夹心冷法制备SF-HP温敏性水凝胶。称取一定量的HP于西林瓶,加入含SF适宜浓度的去离子水,置4℃冰箱中过夜,使其充分吸水溶胀溶解,得到分散均匀、清澈澄明的SF-HP水凝胶溶液。

1.2.2水凝胶胶凝温度的测定 采用搅拌法检测凝胶胶凝温度。西林瓶中放置不同浓度的HP,同时加搅拌子和精密温度计,置于磁力搅拌器水浴加热,转速:100 r·min-1,保持水溶液持续缓慢升温。当其完全停止转动时,温度计显示的温度设定为胶凝温度,每一样品平行测定3次,结果取平均值。

1.2.3SF-HP水凝胶相转变过程 将1 mL的SF-HP溶液置于流变仪中,其胶凝温度为(38~40) ℃,频率设定为1 Hz,应变为0.05%,升温范围为(10~60) ℃,速率设为1 ℃·min-1。观察凝胶弹性模量和黏性模量,将两个模量相等时的温度视为相转变温度[6]。

1.2.4SF-HP温敏性水凝胶扫描电镜 用液氮处理水凝胶样品至固态,冷冻干燥48 h后喷金,然后在扫描电镜下观察水凝胶的形态[4]。

1.2.5实验设计 将大鼠随机分为假手术组、模型组、空白HP水凝胶组、SF溶液组、SF-HP水凝胶组,每组10只。在SCI手术后,SF溶液组经原位注射方式给予SF(100 mg·kg-1),SF-HP水凝胶组给予包载等量SF的水凝胶,空白水凝胶组给予HP水凝胶。依据相关研究,SF改善脊髓损伤的有效量为100 mg·kg-1,大鼠体质量参照200 g,推算出给药量为20 mg。大鼠在手术后1、3、7、14 d进行运动评分(Basso-Beattie-Bresnahan,BBB scale)和斜板实验的行为学测试;d 14处死动物。

1.2.6大鼠脊髓损伤模型的建立[5]方法:注射戊巴比妥钠30 mg·kg-1将SD大鼠麻醉,取俯卧位。暴露位于第8~9胸椎(T8~T9)和第9~10胸椎(T9~10),在T9节段进行椎板切除术打开椎管。采用血管动脉夹(30 g)夹闭脊髓2 min后将动脉夹取下,缝合肌层与皮肤,至动物完全苏醒。

1.2.7BBB评分和斜板功能评分测试运动能力[6]BBB评分:大鼠置于空旷场地,两个观察者对侧站立观察大鼠臀、膝、裸关节,行走,躯干运动及协调情况。观察时间:5 min,期间观察者按评分标准(0~21分)进行评分。

斜板功能评分:将大鼠置于Rivlin斜板上,从水平0°角位置开始,逐渐增大角度,在板上停留5s且不落下的最大角度视为评分结果。

1.2.8HE染色 乙醇梯度脱水后包埋切片,厚度4 μm。(63~65) ℃下烘片3~4 h,切片脱蜡水化,进行苏木精染色7 min。水洗后,乙醇分化5 s,伊红染色2 min,乙醇脱水,二甲苯透明后封片。

1.2.9BDA顺行神经示踪[7]术后14 d,戊巴比妥钠麻醉后,将大鼠固定于脑立体定位仪,切开头皮,确认矢状缝和冠状缝,用微型钻在以下8个点的位置钻孔,第1~2个点在前囟前方2.7 mm,颅中缝左右2.5 mm;第3~4个点在前囟前方1 mm,颅中缝左右2.5 mm;第5~6个点在前囟后方0.4 mm,颅中缝左右1.5 mm;第7~8个点在前囟后方1.8 mm,颅中缝左右1.2 mm。钻孔后,将10%浓度的BDA溶液注射入表面以下1、1.5、2.0 mm的深度,每个深度注射量为1.0 μL,注射时长2~3 min,留针5 min。2周后,取大鼠腰椎(L2)段处进行冰冻切片。最后用荧光显微镜观察BDA标记的脊髓轴突再生情况,统计阳性细胞数。

1.2.10免疫组化检测GAP43、Nestin、GFAP表达 切片脱蜡脱水后,室温静置10 min;PBS洗涤后,置于枸橼酸缓冲盐溶液中,加热至沸腾,放置5 min,PBS洗涤,加入BSA封闭液封闭20 min;吸去封闭液,PBS洗涤,加入一抗,常温孵育2 h,PBS洗涤,加入二抗,37 ℃孵育1 h,PBS洗涤,进行DAB显色液30 s,洗涤后苏木精复染2 min,盐酸乙醇分化3 s,冲洗返蓝10 s,最终脱水、透明、封片。

1.2.11Western blot检测GAP43、Nestin、GFAP表达 组织样本中加入300 μL的细胞裂解液,匀浆离心取上清液,采用BCA试剂盒测定蛋白浓度。电泳及转膜后,封闭液封闭1 h,4 ℃孵育一抗12 h,TBST洗涤,二抗孵育1 h,洗涤后行曝光显影,用薄层扫描分析仪分析结果。

2 结果

2.1 SF-HP水凝胶的制备与评价

2.1.1SF-HP水凝胶胶凝温度的测定 SF-HP温控型水凝胶制备过程中,HP浓度与胶凝温度的变化关系如Fig 1A所示。HP浓度为17%时,SF-HP温控型水凝胶的胶凝温度在37 ℃,符合温敏要求。

2.1.2SF-HP水凝胶相转变过程 温敏型水凝胶具有黏性液体和弹性固体的双重特点,分别用弹性模量和黏性模量来衡量。如Fig 1B所示,17% SF-HP水凝胶在37 ℃时弹性模量与黏性模量相等,即显示固体和液体形式量相等,为温敏性水凝胶温度达到相转变温度时的特征。当温度上升值超过相转变温度点时,再升高温度,SF-HP水凝胶中弹性模量将发挥主要作用,溶液逐渐变凝胶。其弹性模量可达近10 kPa,说明制得的水凝胶已具理想力学强度。

2.1.3SF-HP水凝胶扫描电镜结果 SF-HP水凝胶样品在扫描电镜下(Fig 1C),呈多孔三维网络状立体结构,且孔径大小较均匀。

Fig 1 Characteristic of SF-HP hydrogels

A: Gelation temperature of HP hydrogels; B: Viscous modulus and elastic modulus of the HP hydrogels in PBS; C: SEM images of the surface morphology of the lyophilized SF-HP hydrogels;(a):×1 000;(b):×4 500.

2.2 SF-HP水凝胶对脊髓损伤后行为学的影响假手术组脊神经功能正常,BBB评分为21分。脊髓损伤后,各组BBB评分均稳定在0~1分间,说明动物模型成功建造,损伤较一致。SF给药14 d后,治疗组评分明显高于SCI模型组(P<0.05),SF-HP水凝胶给药14 d后,与SF溶液组相比,评分升高更明显(P<0.05)。斜板评分实验的结果与BBB评分结果一致,给药14 d后,SF治疗组所测得的斜板角度与SCI组相比,明显增加(P<0.05);SF-HP水凝胶组评分与SF溶液组相比,明显增加(P<0.05)。见Fig 2。

Fig 2 Motor function changes and improvement

A:BBB locomotion assessment on d 1, d 3, d 7, d 14 after SCI; B: The inclined plane test scores on d 1, d 3, d 7, d 14 after SCI.*P<0.05,**P<0.01vsSCI group;#P<0.05vsSF group.

2.3 SF-HP对脊髓损伤后HE病理学的影响Fig 3A为假手术组大鼠T8~T10段脊髓的HE染色镜下的结果,脊髓组织结构正常,白质中神经纤维走向平行一致,且具一定的连续性;灰质中,神经元形态良好、分布均匀。Fig 3B显示了造模后14 d,模型组大鼠受损脊髓内部出血,结构紊乱,出现组织水肿。HP处理组脊髓损伤程度与模型组相似,表明HP单独给药无明显疗效(Fig 3C)。在给予SF溶液14 d后,脊髓灰质神经元略有增加,白质中的神经纤维排列具有一定的方向性,但排列仍然紊乱,但灰质中神经元数量不多(Fig 3D);相比于SF溶液组,给予SF-HP水凝胶14 d后,脊髓修复状态良好,灰质白质界限较为清晰,神经细胞明显增多,神经纤维排列整齐,空洞状有明显改善(Fig 3E)。

Fig 3 HE staining(40× and 200×) 14 days after SCI

2.4 BDA顺行神经示踪如Fig 4所示,BDA神经示踪后,经过免疫荧光染色,脊髓中阳性的神经元有绿色荧光。假手术组正常功能的脊髓具有明显的绿色荧光;模型组不显示荧光,BDA阳性细胞数与假手术组相比明显减少(P<0.01);与模型组相比,SF治疗组出现绿色荧光,BDA阳性细胞数增加(P<0.05);与SF溶液组相比,SF-HP水凝胶组的BDA阳性细胞数更多(P<0.05)。

Fig 5 Immunohistochemical staining results of GAP43, Nestin and GFAP 14 days after SCI(400x)

2.5 SF-HP对脊髓损伤后神经修复相关蛋白表达的影响

2.5.1免疫组织化检测 为深入研究SF-HP对脊髓损伤修复作用的机制,本实验通过免疫组化检测了GAP43、Nestin、GFAP的表达。Fig 5结果表明,假手术组未损伤的脊髓Nestin、GFAP、GAP43蛋白表达较少,模型组损伤14 d后,Nestin、GAP43、GFAP蛋白表达增加。给予SF治疗14 d后,Nestin和GAP43表达增加明显,GFAP表达减少。给予SF-HP水凝胶14 d后,观察到相似结果。由于在定性分析中无法比较SF-HP水凝胶与SF溶液对相关蛋白表达的影响,因此,采用Western blot进行定量研究。

2.5.2Western blot检测 如Fig 6所示,术后模型组大鼠脊髓的GFAP表达与假手术组相比明显增加(P<0.01),Nestin、GAP43表达无明显变化。给予SF治疗后,GFAP明显降低(P<0.05),而Nestin、GAP43表达增加(P<0.05);与SF溶液组相比,SF-HP水凝胶组GFAP表达下降更为明显(P<0.05),同时,Nestin、GAP43表达增加更为明显(P<0.05)。

3 讨论

脊髓损伤后的神经细胞死亡是主要源于继发性损伤,因为损伤后星形胶质细胞被大量激活,形成反应性星形胶质细胞,抑制营养因子的表达,同时上调抑制轴突生长相关蛋白的表达,阻碍受损神经元的修复和再生。SF具有抗神经凋亡作用[8],研究发现,SF能改善脊髓损伤引起的运动功能障碍[2-3],并且发现其可促进神经营养因子表达。但SF疗效不佳,主要原因在于传统给药方式的局限,导致药物无法达到损伤部位。

Fig 6 Effect of SF-HP on expression of GAP43,Nestin, GFAP in spinal cord of

A: Blots of GAP43, Nestin, GFAP expression in five groups; B: Analysis results of Western blot.**P<0.01vssham group;#P<0.05vsSCI group;△P<0.05vsSF group

本实验采用新型合成材料HP包载SF,制备SF-HP水凝胶。该材料具有以下特点[9]:① 适于人体应用的相变温度,可以在室温时呈液体状态,在人体温度(37℃)时迅速形成三维网状结构水凝胶,并保持较好的浸润性;② 保持较好的抗凝活性,有利于防止神经瘢痕和周围血栓的形成。

实验结果表明,HP适宜浓度为17%的SF-HP水凝胶,胶凝温度符合要求。通常水凝胶在成凝胶态后弹性模量可达10 000 Pa左右,表明水凝胶具备一定的抗力性,与黏性模量占主要地位的溶液态相比,力学强度发生巨变。制得的SF-HP水凝胶已经符合这一点,为体内外实验中支撑细胞生长,促进组织修复奠定基础。凝胶具有明显的多孔状三维结构,微观结构显示其能在受损脊髓部位起到良好支撑作用,孔径大小均一的特点也适宜包载治疗药物,符合本研究的需求。

实验通过行为学研究,比较SF溶液与SF-HP水凝胶的疗效。结果发现,SF-HP水凝胶组疗效明显优于SF溶液组,并且给药后7 d就能观察到行为学的变化。而在给药14 d,HE染色发现,SF-HP水凝胶组能更好地改善损伤后的脊髓内部出血、组织水肿及脊髓结构空洞化。这一结果也印证SF确实具有改善脊髓损伤的作用,同时本研究结果也表明,SF-HP水凝胶能明显提高修复损伤脊髓的疗效。

确认神经损伤后是否具有再生能力,依靠行为学评价和病理学初步评价尚不完整的,故采用BDA顺行神经示踪技术,以更直观的角度观察神经轴突的修复和再生情况。BDA是研究神经功能变化的示踪剂,可被神经元摄取,并沿轴突转运,具有较好的稳定性[10]。示踪实验结果显示SF-HP水凝胶组大鼠腰椎(L2)段处有较强的绿色荧光,与正常组大鼠的神经传导功能无明显差异,并且荧光明显强于SF溶液组,表明经水凝胶包载的SF显示出优越的促受损脊神经轴突再生修复的能力,明显增强大鼠的神经传导功能。

脊髓损伤的恢复主要依赖于神经元轴突的修复与再生,而轴突再生受到多方面的影响,本实验通过对脊髓损伤神经修复通路的相关蛋白进行检测,初步揭示SF-HP水凝胶增强脊髓神经功能重建的机制。损伤后产生的反应性星形胶质细胞是神经元轴突再生的主要障碍,星形胶质细胞被激活成为反应性星形胶质细胞[11]。激活后的细胞发生改变,在损伤部位附近表达标志性的蛋白,改变损伤部位及其周边的微环境,抑制神经元生长及轴突再生,这是阻碍神经元轴突再生的主要因素[12]。Nestin是神经干细胞所特有的一种中间丝蛋白[13];GAP43是神经生长相关类蛋白,在生长、分化和再生等各个阶段的轴突以及突触中含量极高,其表达可以反映神经轴突的生长及再生情况[14];GFAP是星形胶质细胞的特异蛋白,可分析星形胶质细胞在脊髓损伤中的增生情况[15]。通过对以上蛋白进行免疫组化染色实验与蛋白质印迹实验,发现SF-HP水凝胶可以在脊髓损伤修复进程中,促GAP43和Nestin的表达,使神经干细胞数量增多,促使其分化生长,减少神经细胞中胶质的含量,逆转反应性星形胶质细胞导致的神经损伤。同时降低GFAP,抑制星形胶质细胞被激活,阻止反应性星形胶质细胞的生成。加之温敏优势,使其在体内温度下迅速转变为凝胶态,包载的SF与脊髓损伤部位产生良好接触,减少药物的流失和不良反应的发生,结合凝胶制剂缓慢释放药物的作用,使SF在受损脊髓周围得以长久停留,促进药物减少胶质瘢痕的形成,增强轴突再生的作用,利于对损伤脊髓的修复。

综上所述,本研究从行为学、病理学、电镜微观形态学及分子生物学多角度综合评价了SF-HP温敏型水凝胶对脊髓损伤的治疗作用,论证了HP温敏型水凝胶对SF疗效的增强作用,同时揭示了SF改善脊髓损伤的作用涉及神经营养机制与胶质瘢痕的抑制。

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