复合酶法提取白雪茶多糖工艺研究

祁文露 肖聪 赵艳 李学颖 杨青松

摘要：以民族药白雪茶为材料，多糖提取率为检测指标，在单因素试验基础上，设计正交试验确定复合酶法提取多糖的最佳工艺条件，并测定多糖在体外清除DPPH和亚硝酸盐能力。结果表明，在复合酶为纤维素酶和木瓜蛋白酶（质量比1∶4）条件下，酶解温度50 ℃，酶解时长1.0 h，pH 5.0，酶浓度3.0%，白雪茶多糖提取为10.81%。白雪茶多糖对亚硝酸盐和DPPH自由基均有一定的清除作用，且表现为剂量效应关系。当白雪茶多糖浓度为2.5 mg/mL时，对DPPH自由基的清除率达98%。多糖浓度为2.0 mg/mL时，对亚硝酸钠的清除率达19.8%。采用复合酶法提取白雪茶多糖，可以明显提高多糖的提取率，且该工艺提取的白雪茶多糖对DPPH自由基有很好的清除作用。

关键词：复合酶法;白雪茶;多糖;提取;正交试验

中图分类号：S571.1;R284.2         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）17-0104-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.17.028           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： Based on single factor experiment， the optimum conditions for the complex enzyme extraction of polysaccharides from the ethnodrug Thamnolia spp. was determined by an orthogonal experiments and analysis of variance taking extraction rate as index. Then the ability of polysaccharides to scavenge DPPH and nitrite was determined in vitro too. The results as follow： the extraction rate of Thamnolia spp. polysaccharides was the highest in the case of complex enzymes of cellulase and papain （mass ratio 1∶4）， the enzymolysis temperature at 50 ℃， the enzymolysis time in 1.0 h， pH value at 5.0， and the enzyme concentration in 3.0%. And in these case， the total sugar yield is 10.8%. The Thamnolia spp. polysaccharide extracted by this condition had a certain scavenging effect on nitrite and DPPH free radicals， and showed a dose-effect relationship. When Thamnolia spp. polysaccharide concentration was 2.5 mg/mL， the DPPH radical scavenging rate was 98%. When the polysaccharide concentration was 2.0 mg/mL， the scavenging rate of sodium nitrite was 19.8%. The results showed that the extraction of polysaccharide from Thamnolia spp. by complex enzyme method can significantly increase the extraction rate of polysaccharides. And the polysaccharides extracted from this technology from Thamnolia spp. had good DPPH free radical scavenging ability.

Key words： complex enzymes method; Thamnolia spp.; polysaccharides; extraction; orthogonal experiment

白雪茶（Thamnolia spp.）又称地茶、太白茶，为地衣类地茶科地茶属植物，多生长在海拔4 000～4 200 m的高原雪线附近的阴湿苔地和岩石上[1]。白雪茶可以清热解毒、生津止渴、清肝明目，是当地人的天然保健饮品和传统药物。许多中外学者对白雪茶的化学成分进行分析，发现其含有各种多糖、甾体、酚酸、缩酚酸、挥发性成分等，同时还富含11种人体必需矿物质元素[2]。虽然白雪茶具有几百年的饮用历史，但由于地理分布特殊、野生资源数量少、生长缓慢等原因，其应用还未得到大众的重视。许多研究表明，各种植物来源的多糖具有良好而广泛的生物活性，多糖及其衍生物是生物医药方面的研究开发热点之一[3]。林春榕等[4]用水提醇沉法从未经复合酶处理的白雪茶中提取多糖，总糖得率为2.609%。该研究还表明白雪茶多糖具有促进免疫功能和清除自由基（OH和O2-）的作用。生物酶法作为提取生物活性成分的新技术已十分成熟，并广泛应用于多糖加工行业[5-7]，但目前尚未見将生物酶法应用于白雪茶的提取和制备中。本研究利用单因素试验和设计正交试验优化白雪茶多糖的复合酶法提取工艺，并测定其在体外清除亚硝酸盐和DPPH自由基的能力，为后期研究白雪茶多糖相关药理作用提供依据。

2.2  正交试验结果

正交试验结果见表3。由表3可知，复合酶浓度、酶解时间、酶解温度对白雪茶多糖提取率影响较大，另外两个因素影响较小。根据k值分析，复合酶法白雪茶多糖的最佳提取工艺组合为复合酶浓度3.0%，酶解时间1.0 h，酶解温度50 ℃，复合酶比例1∶4，酶解pH 5.0。

按照上述优化条件进行验证，测得白雪茶多糖提取率为10.81%（RSD=1.14%）。

2.3  体外生物活性试验

由图6可知，白雪茶多糖对DPPH自由基有较好的清除作用，并且随着多糖浓度的提高，清除率也提高，多糖浓度在0.5～1.5 mg/mL时，白雪茶多糖对DPPH自由基的清除率随着多糖浓度提高，清除率增加较快。多糖浓度提高到2.5 mg/mL时，清除率达到98%，表明白雪茶多糖对DPPH自由基有很好的清除能力。白雪茶多糖和抗坏血酸都对亚硝酸钠也有一定的清除作用，白雪茶多糖浓度为2.0 mg/mL时，达到最大清除率，为19.8%。抗坏血酸在浓度为1.5 mg/mL时清除率达到最大值96.7%，虽然白雪茶多糖对亚硝酸盐清除能力没有抗坏血酸强，但也有一定清除作用。

3  讨论

目前，多糖提取的方法有很多种，但传统提取方法操作繁琐、时间长而且提取率相对较低。相比于超声波、微波辅助提取法在大规模生产时的局限性，酶处理法在成本和使用上更加简便，对设备和工艺的要求也较少[10]。酶反应条件温和，操作简单，选择性强。由于组织中的一些杂质类成分如蛋白质、果胶等影响提取液的质量，通过添加适当的酶，经过温和的酶解反应可将液体中杂质除去，使体系的澄清度增加。另外，酶解法的温度和pH不但影响酶的稳定性，还影响酶活性中心必需基团的解离状态和底物的解离状态[11]。因此，在最适pH和温度范围内，底物才能与酶成分结合，产生大量的产物。将温度和pH设计到最佳条件，改变了以往提取时资源的严重浪费，对白雪茶资源的开发和利用具有重要的意义。

试验首次采用复合酶辅法提取白雪茶多糖，使白雪茶多糖提取率得到了大幅度提高，提取率为10.81%。与金刷把多糖提取率4.42%[12]、红雪茶多糖提取率8.91%[13]、玄参多糖提取率8.98%[14]等相比，白雪茶多糖提取率较高，但不及金银花多糖提取率12.36%[15]和南瓜多糖提取率20.13%[16]，原因可能是由于金银花和南瓜的总糖含量较高。比较之前林春榕等[4]使用水提法提取白雪茶多糖，本试验的提取率较高。可能是复合酶中纤维素酶能快速分解细胞壁的纤维素，从而破坏细胞壁的结构，加快多糖溶出的速率[7]，木瓜蛋白酶使糖蛋白和蛋白聚糖中游离的蛋白质水解，降低它们之间的结合，利于多糖的浸出。其次利用正交试验确定了白雪茶多糖的最佳提取条件，缩短了提取时间。但要大规模应用于产业开发与加工，还需考虑与其他提取方法联用再进一步优化提取率。

随着生命科学的不断发展，自由基已成为人们研究的热点，人体内过多的自由基会引起酶、氨基酸、蛋白质等氧化破坏，对内脏器官、免疫系统的形态动能产生影响，从而引起机体疾病，甚至死亡[17]。试验测定了白雪茶多糖对DPPH自由基和模拟胃液（pH=3）条件下对亚硝酸盐的清除能力，结果表明，白雪茶多糖对DPPH自由基有较强的清除作用，在白雪茶多糖浓度达到2.5 mg/mL时清除率达到98%，但对亚硝酸盐的清除能力不及同浓度抗坏血酸，清除能力较弱，最大清除能力只达到19.8%。与其他三种地衣（金刷把、黑石耳和红石耳）的粗多糖相比较，白雪茶多糖清除DPPH自由基的能力比较弱[18]，下一步对白雪茶多糖的研究可以考虑从其他方面入手，例如抗肿瘤活性和抗炎活性等。

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