纤维素降解菌的分离及发酵液对大豆种子萌发的影响

孙光壮 朱栗纬 王亚 崔莹莹 喻文新 孙冬梅 林志伟 肖翠红

摘要：为提高秸秆还田过程中的腐解效率，采用CMC-Na培养基、刚果红和滤纸平板培养基分离出1株纤维素降解能力强的放线菌菌株，同时利用种子萌发法研究该菌对大豆[Glycine max （Linn.） Merr.]种子的促生作用，并分析了纤维素降解菌发酵液对大豆种子过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）活性以及丙二醛（MDA）含量的影响。结果表明，分离出的菌株具有较强的分解纤维素能力，而且不同浓度的发酵液對大豆种子的萌发率和抗氧化酶活性均有影响。当发酵液浓度为100.0%时，大豆种子的萌发率达到最高值，为74.53%，与对照（不加菌液的Mendals培养基）相比提高了21.96个百分点;大豆种子CAT和SOD活性最强，与对照相比分别提高了291.45%和106.64%;POD活性为25.6 U/（mL·min），比对照提高了101.96%，但与纯水培养相比下降了14.65%。MDA含量在发酵液浓度为16.7%时最低，与对照相比降低了21.37%。初步证实了纤维素降解菌发酵液中含有能促进大豆种子萌发和抗氧化酶活性升高的物质，以及保护膜组分的物质。

关键词：纤维素降解菌;大豆[Glycine max （Linn.） Merr.];种子萌发

中图分类号：Q936;S565.1         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）17-0016-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.17.004           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： In order to improve the decomposition efficiency of straw returning to the field， an actinomycete strain with strong cellulose degradability was isolated by using CMC-Na medium， Congo red medium and filter paper plate medium. At the same time， the seed germination method was used to study the growth-promoting effect of the strain on soybean [Glycine max （Linn.） Merr.] seeds. The activities of POD， CAT and SOD  and the content of MDA in soybean seeds were also studied. The results showed that the isolated strain had a strong ability to decompose cellulose， and the germination rate and antioxidant enzyme activity of soybean seeds were changed after treated with different concentrations of cellulose-degrading bacteria fermentation broth. When the concentration of fermentation broth was 100.0%， the germination rate of soybean seeds reached the highest， was 74.53%， increasing by 21.96 percent compared with the control（Mendal's medium without bacterial fluid）; the activity of CAT and SOD was the strongest， which increased by 291.45% and 106.64% respectively compared with the control; and the POD activity was 25.6 U/（mL·min）， 101.96% higher than that of the control， but it was 14.65% lower than that of the pure water culture. The content of MDA was the lowest at 16.7%， which was 21.37% lower than that of control. It was preliminarily confirmed that the fermentation broth of cellulose-degrading bacteria contained substances which could promote the germination of soybean seeds and increase the activities of antioxidant enzymes， as well as protective membrane components.

Key words： cellulose-degrading actinomycetes; soybean[Glycine max （Linn.） Merr.]; seed germination

大豆[Glycine max （Linn.） Merr.]是中国主要的粮食作物之一，年产量约1 500万t，每年在大面积种植带来巨大经济效益的同时，也会产生大量的农业废弃物——大豆秸秆，其产生量约2 500万t/年[1，2]。大豆秸秆中富含大量纤维素类物质、氮、磷、钾、粗蛋白质等营养成分和许多微量元素[3]，其中纤维素类物质是限制其快速降解的因素之一。

纤维素是自然界中分布最广、储量最多的碳水化合物，是植物细胞壁的主要成分，是一种可持续的能源物质，同时也是尚未得到充分利用的一类可再生资源[4，5]。但是纤维素在降解过程中存在周期长、降解困难等问题[6]。为了处理难以降解的秸秆废弃物，农业生产中多以焚烧的方式进行处理，从而造成大量能源浪费，同时伴有严重的环境污染问题。因此，寻找一种高效、节能环保的处理秸秆的方法势在必行。

目前，利用微生物处理秸秆是研究的重点。它具有纤维素分解效率高、无污染的特点。自然界中存在大量能够产生纤维素酶的微生物，这类微生物资源经分离筛选和驯化后一般具有对人畜无害、生物转化效率高、作用条件温和等优点，因而具有很大的应用潜力，尤其在生物质固体废弃物资源化方面更具有广阔的应用前景[7，8]。但是利用微生物处理秸秆的关键问题是如何高效地解决纤维素降解问题。目前国内用于分解纤维素的微生物大多是真菌，尤其是以木霉属（Trichoderma）和曲霉属（Aspergillus）为主，但在放线菌属中也不乏存在一些高效的菌株。

超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）是植物活性氧清除系统中重要的保护酶，它们能有效地阻止高浓度氧的快速积累，防止膜脂的过氧化作用，延缓植物的衰老，增强植物抗逆性[9]。丙二醛（MDA）是常用的膜脂过氧化指标，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度。本试验通过使用选择培养分离的方法，获得了1株高效纤维素降解菌，通过研究该菌株不同发酵液对大豆种子的促生作用及抗氧化酶活性试验，以期为大豆秸秆降解还田后对作物生长的研究提供理论基础。

1  材料与方法

1.1  试验材料

供试大豆品种为绥农29，由黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院微生物实验室提供。

培养基：①赫奇逊分离培养基。KH2PO4 1.0 g，NaCl 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaNO3 2.5 g，FeCl3 0.001 g，CaCl2 0.1 g，琼脂18 g，去离子水1 000 mL。②刚果红筛选培养基。K2HPO4 0.50 g，MgSO4 0.25 g，纤维素粉1.88 g，刚果红0.20 g，琼脂20 g，加去离子水至800 mL，调整pH为7.0，补充到1 000 mL，用于纤维素降解菌的复筛。③高氏1号培养基。可溶性淀粉20 g，KNO3 1.0 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01g，琼脂20 g，去离子水定容至1 000 L，pH为7.4～7.6，121 ℃灭菌30 min后，用于纤维素降解菌的活化。④Mendals培养基。KH2PO4 2.0 g，（NH4）2SO4 1.4 g，尿素 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，CaCl2 0.3 g，纤维素粉或滤纸浆 5.0 g，去离子水定容至1 000 mL，121 ℃灭菌30 min后，用于纤维素降解菌的液体培养。

1.2  方法

1.2.1  菌种的分离及初步鉴定  称取长期堆腐土壤样品10 g，置于盛有90 mL无菌水的（加玻璃珠）三角瓶中，振荡20 min制成菌悬液，依次稀释成梯度为10-1、10-2、10-3不同浓度。然后将赫奇逊培养基冷却后倒皿，铺上灭过菌的新华滤纸，将不同浓度的土壤菌悬液在滤纸平板上点样，每个平板5～6个点，37 ℃培养5 d后，将生长出的放线菌菌株点接于刚果红平板复筛，37 ℃培养，选出水解圈大的单菌落保存。

供试菌株在高氏1号培养基进行活化，37 ℃培养4 d后，进行插片法观察菌体的形态特征并拍照。

1.2.2  纤维素降解菌发酵液的制备  将纤维素降解菌接种到高氏1号斜面培养基上活化5 d，加入无菌水10 mL，用接种环将纤维素降解菌菌落刮下，制成浓度为（1.0±0.2）×107 CFU/mL的悬液。在装有200 mL Mendals培养基的500 mL三角瓶中加入菌体悬液3 mL，28 ℃、160 r/min摇床培养10～15 d，滤纸过滤后，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌得到无菌濾液。4 ℃保存备用，3次重复。将无菌滤液和无菌水配制成不同浓度的发酵液，分别为0、16.7%、33.3%、50.0%、66.7%和100.0%，共6个处理，以不加菌液的Mendals培养基为对照，记为CK。选取饱满、大小均匀的大豆种子，用去离子水冲洗种子表面，然后用0.1%的升汞杀菌8 min，无菌水冲洗3次，均匀摆放在铺有3层滤纸并加有5 mL无菌水的培养皿中，每皿50粒。向每个皿中均匀喷洒对应浓度的处理液10 mL，每处理3次重复，28 ℃恒温暗培养。从处理的第二天开始，每天同一时间记录各个培养皿中萌发的种子数，每天同一时间补充10 mL发酵液。发芽标准为胚根伸出种脐部分长度超过种子纵径一半为标准，要求胚根发育正常，胚根弯曲并呈螺旋状盘绕者不予统计。7 d后从每个培养皿中随机取20粒发芽种子，统计种子萌发率。萌发率=（萌发种子数/供试种子总数）×100%。

1.2.3  抗氧化酶活性及丙二醛含量的测定  将上述处理中各处理第四天的部分种子取出，放入离心管中冷冻保存，用于酶活性和MDA含量的测定。POD活性测定采用愈创木酚法，以1 min内OD470 nm变化0.01为1个酶活性单位;CAT活性测定采用紫外吸收法，以1 min内OD240 nm减少0.1的酶量为1个酶活性单位;SOD活性测定采用NBT（氮蓝四唑）光化还原法，以抑制NBT光还原50%的酶量为1个酶活性单位;MDA含量测定采用硫代巴比妥酸（TBA）法。

1.3  数据处理

采用SPSS软件和Excel软件进行数据处理。

2  结果与分析

2.1  纤维素降解菌株的分离与形态学观察

利用赫奇逊培养基对土壤样品进行分离纯化后，获得可以降解纤维素的细菌23株、放线菌8株、真菌9株。选取不同的放线菌单菌落接种于刚果红培养基中，通过检测点接3 d后不同菌株的水解圈直径发现，不同菌株水解能力不同，其中编号为1的菌株水解圈直径最小，仅为1.5 mm，编号为4的水解圈直径最大，可达8.8 mm，具体情况见表1，故后续菌株鉴定及试验均使用该菌株。

通过单菌落观察发现该菌株菌落直径3～4 mm，菌落表面呈粉状，基内菌丝为灰白色，气生菌丝也为灰白色，孢子丝为白色。利用插片法观察该菌株基内菌丝略粗于气生菌丝，不断裂，孢子丝生于气生菌丝上，孢子丝直或稍波曲，以单链生为主（图1），初步判定该菌株属于链霉菌属（Streptomyces sp.）。

2.2  发酵液对大豆种子萌发的影响

由图2可以看出，大豆种子经过发酵液浓度为0、16.7%、33.3%、50.0%和100.0%的纤维素降解菌发酵液处理后，种子萌发率均高于对照，相对提高了19.51、14.66、18.08、5.42和21.96;只有在发酵液浓度为66.7%时对种子萌发有抑制作用。在发酵液浓度为100.0%时，种子的萌发率达到最高，为74.53%，与对照相比提高了21.96个百分点;当发酵液的发酵液浓度为66.7%时发芽率最低，为35.09%。结果证明，纤维素降解菌发酵液对大豆种子有较强的促生作用，且在发酵液浓度为100.0%时具有最强的促生作用。

2.3  发酵液对抗氧化酶活性的影响

2.3.1  发酵液对POD活性的影响  从图3可以看出，经过不同浓度的纤维素降解菌发酵液处理后的大豆种子POD活性均较高，当发酵液浓度为100.0%时，POD活性为25.6 U/（mL·min），与对照相比提高了101.96%，但与纯水培养（发酵液浓度为0）相比下降了14.65%。

2.3.2  发酵液对CAT活性的影响  从图4可以看出，不同浓度纤维素降解菌发酵液处理后的大豆种子CAT活性不同，在发酵液浓度为100.0%时，CAT活性达到最高，为2.28 /（mL·min），与对照相比提高了291.45%。在发酵液浓度为16.7%时，对酶活性起到抑制作用，此时酶活最低，为0.37 U/（mL·min），比对照下降了37.13%。

2.3.3  发酵液对SOD活性的影响  由图5可知，各纤维素降解菌发酵液浓度对酶活性均起到促进作用，发酵液浓度为100.0%时，SOD活性达到最高，与对照相比提高了106.64%。

2.3.4  发酵液对MDA含量的影响  结果（图6）表明，除纤维素降解菌发酵液浓度为16.7%的处理之外，其他处理与对照相比，MDA含量均无显著性差异。当发酵液浓度为16.7%时，MDA含量达到最低，与对照相比降低了21.37%。

3  小结与讨论

作物种植中的秸秆无害化处理一直是研究的热点，秸秆焚烧不仅污染环境，还会造成资源浪费，也是目前雾霾形成的主要因素之一，因此纤维素降解微生物对于解决秸秆降解意义重大。长期以来，尽管真菌和细菌对纤维素降解作用引起普遍关注，但是放线菌在纤维素分解过程中的作用不容忽视[10]。刘超等[11]研究发现，放线菌中的链霉菌属对纤维素的降解种类较多，对促进纤维素资源化利用具有现实意义。

另外，秸秆分解产物，尤其是纤维素降解菌对植株的影响也是近年来人们比较关注的内容。赵艳婷[12]通过测定芽孢杆菌属菌株AN-6对玉米幼苗的影响证明，细菌发酵液可以促进植物幼苗的生长，并且会提高作物的抗逆性。大量研究表明，POD、SOD、CAT与植物抗逆过程密切相关[13，14]，生物体进行一切生命活动都伴随氧代谢同时产生活性氧，当植物处于胁迫条件下，活性氧代谢平衡被打破，产生大量氧自由基（Reactive oxygen species，ROS），对细胞造成损害，从而影响植物正常生长，最终导致产量、品质下降[15-17]。逆境胁迫引起ROS的積累可以通过抗氧化酶系统来消除，其中SOD、POD与CAT在植物细胞内相互协调，能有效清除过剩的氧自由基引起的膜脂过氧化及其他伤害[18]，而MDA含量高低是膜脂过氧化作用强弱的一个重要指标[19]。本试验所选取的纤维素降解菌对大豆种子的萌发有较好的促进作用，经过不同浓度发酵液处理的大豆种子在萌发过程中的SOD、POD和CAT活性均有明显提高，其中在发酵液浓度为100.0%时，促进作用相对最强。MDA含量在发酵液浓度为16.7%时最低，证明低浓度的发酵液对细胞膜的损伤作用最小，对大豆植物细胞有保护作用，有利于防御病菌入侵，能有效降低种子萌发过程中病害的发生。

纤维素降解菌发酵液对大豆种子萌发与抗氧化酶活性的多次重复试验结果证实，其促生与抗逆作用效果稳定，因而该发酵液可能成为增强大豆种子萌发过程的抗逆性的生物资源。以上的研究结果可为以后在生产实践过程中更好地利用该菌株降解产物用于大豆生产提供参考。此后，还将继续优化该纤维素降解菌的培养条件，对降解能力不同的菌株进行复合，以提高其降解能力，为实现大规模的生产提供重要理论依据。

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