基于微流控的电化学生物传感平台研究进展

边孟孟, 张 云, 袁亚利

(桂林理工大学化学与生物工程学院，广西桂林 541004)

1 引言

微流控是一种流体处理技术，利用尺寸为几十到几百微米的通道来处理或操纵微量(10-9～10-18L)流体[1]。微流控技术很早就已经应用于分析化学中，它具有多种优点，如使用极少量的样品和试剂，以高分辨率和高灵敏度进行分离检测，低成本，分析时间短[2]等。微流控最为明显的特征之一是微尺度环境下具有独特的流体性质，如层流和液滴等。这种特有的流体现象使微流控配备了在空间和时间尺度上控制单分子的基本功能。

微流控芯片是微流控技术实现的主要平台，具有将生物、化学等实验室的基本功能微缩到一个几平方厘米芯片上的能力，因此又被称为芯片实验室(Lab on a Chip，LOC)。现阶段，主流形式的微流控芯片多由微通道形成网络，以可控流体贯穿整个系统，用以实现常规化学和生物等实验室的各种功能。微流控芯片的最基本特征和最大优势是多种单元技术在微小可控平台上灵活组合和规模集成[3 - 4]。微流控芯片一般具有液体可控、消耗样品少、操作简单的特点，可在几分钟甚至更短时间之内进行上百种样品同时分析，并且可以实现在线样品预处理以及分析全过程。目前，微流控技术两个重要应用方向是临床诊断仪器和体外仿生模型[5]。总体而言，微流控技术目前以生命科学为主要应用对象，在生物医学[6]、细胞生物学[7]、单细胞分析[8]、生物传感[9]、分离科学[10]、化学合成[11]和高通量药物筛选[12]等方面均有涉及，是当前微全分析系统(Micro Total Analysis System,μTAS)领域的重点发展对象。

根据定义，生物传感器是一个独立的集成系统[13]，它通过使用生物感应元件(也称为生物识别元件)和信号转导元件[14]，选择性和定量地检测生物学上与生命相关的分析物，如DNA、蛋白质、细胞、外泌体等[15]，以及离子溶解气体、药物和毒素等。当生物感应元件识别特定分析物时，换能器元件通过将生物识别期间产生的物理或化学信号转换成可测量的信号来提供关于分析物的定量或半定量信息。生物传感器在国民经济的各个部门如食品、制药、环境、化工、医学等方面有广泛的应用前景。随着生命科学、信息科学和材料科学发展的推动，可以预测未来生物传感器将会具有功能多样化、智能集成化、深度产业化等特点。

对于常规的生物或化学实验来说，检测都是其不可或缺的一步。以微流控生物芯片为平台进行的各种化学、生物反应和分离等通常都发生在微米量级尺寸的微结构中，这与传统意义上的类似操作有很大差别。为此，对于芯片上检测器的要求更为苛刻。根据检测方式的不同，微芯片上检测器一般可分为四大类，即光学检测器、电化学检测器、色谱检测器和其他联用检测器等。本文将以电化学检测为主，结合微流控生物传感进行介绍。电化学检测是通过将溶液中的待测物产生的化学信号转变为电信号以实现对待测组分检测的一种方法。电化学检测的主要优势是灵敏度高、选择性好、体积小、装置简单、成本低廉，且因其优异的兼容性，适合微型化和集成化。

近年来，基于微流控的电化学生物传感器已经被开发用于快速、灵敏和选择性检测细胞代谢物[16]、DNA杂交[17]、毒素[18]、激素[19]等。在传感系统中引入具有不同功能和结构的纳米材料，能够促进该技术在不同基质中检测病原体[20]以实现预防威胁性疾病，如霍乱毒素[21]、H1N1/H5N1/H7N9病毒[22]的目标。在面向即时诊断的生物传感领域，微流控电化学生物传感平台的应用几率普遍增加，有助于研究者找到即时检测(Point of Care Test，POCT)设备的研究发展方向。

2 基于微流控的电化学生物传感器的应用

具有生物传感能力的微流控芯片，结合电化学检测，在涉及即时检测的领域有重要应用。微流控芯片能承载多种单元技术并将其灵活组合，多个传感器和传感区域结合在微流控芯片以增强其作用。因此，理想的芯片生物传感器具有成本低，集成度高，快速且灵敏的优点。目前，微流控平台可以分为这几类：连续流和液滴流通道微流控(图1(a)和1(b))，数字微流控(图1(c))以及纸基微流控(图1(d))。本综述将重点介绍这几类微流控电化学生物传感器在近些年的相关应用。

图1 不同类型的微流控平台。(a)连续流动通道微流控平台，通常在玻璃或塑料基质上构建PDMS的微通道，其中混合溶液(试剂1和2)从一侧的入口进入，并且从另一侧的出口收集反应产物；(b)液滴通道微流体系统，其中液滴(水)在不混溶的载液(油)中产生[22]；(c)数字微流控平台，由纸或玻璃基板上的电极阵列构成，其中离散的液滴可以通过电极的有序致动而移动，混合，分裂和分配；(d)纸基微流控平台，包括通过在纸基上打印疏水区域形成的亲水通道，其中液体通过毛细管作用在亲水通道中流动[23]Fig.1 Schematics showing different types microfluidic platforms:(a) continuous flow channel microfluidic platform,usually built on glass or plastic substrate using PDMS based microchannels,where miscible liquids(reagent 1 and 2) enter from inlets on side and the resulting product is collected from an outlet on the other side of the platform.(b) Droplet flow channel microfluidic system,where droplets(water) are generated in an immiscible carrier liquid(oil).The size,shape,frequency,speed can be tuned using various parameters[22].(c) Digital microfluidic platforms comprising array of electrodes on paper or glass substrate,where discrete liquid droplets can move,mix,split and dispense by sequential actuation of electrodes.(d) Paper-based microfluidic platform comprising hydrophilic channels formed by printing hydrophobic barriers on paper substrate,where liquid flows in hydrophilic channels through capillary action[23]

2.1 通道微流控电化学生物传感

通道微流控先作为化学分离的工具出现，之后与芯片技术结合以制造小型化设备。通道微流控涉及封闭通道，通过气动压力或电场力来驱动液体。它的单元形式包括通道、阀门、混合器和微泵。通道微流控可分为连续流动(图1(a))和液滴流动(图1(b))[23]。连续流体微流控芯片可以精确处理纳米级的样品体积(如蛋白质、DNA、细胞等)，因此它在化学和生物分离[21]、微反应器[22]、μ-TAS[23]中可以完成从样品预处理到检测的整个分析过程。例如，Noh等[24]设计了利用连续流体微流控通道装置与新型电化学生物传感器相结合用以检测痕量邻苯二甲酸酯(PE)的分析平台，所提出的方法用于研究内分泌干扰物对哺乳动物肾细胞的影响。液滴微流控芯片利用两种互不相溶的液体(如水相和油相)，将其中的一种作为连续相，另一种作为分散相，分散相以微小体积单元(10-15～10-9L)的形式分散于连续相中，形成液滴在通道内流动[25 - 26]。这种液滴微流控能够模拟单个细胞的环境，从而进行生物和化学反应，具有高通量筛选和敏感生物测定的主要优点，如聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)技术[27]。

微通道形式为电化学生物传感提供了许多分析优点，包括高通量，集成度好，持续性久，便携性和分析时间短等。例如，Zribi等[28]将修饰了二茂铁的碳纳米管(碳纳米管(CNTs)/二茂铁)作为氧化还原标记的生物传感器集成在电化学微流控多路联用平台上(图2)，用于直接检测病原性病毒DNA(来自临床分离的结核分枝杆菌的丙型肝炎和基因组DNA)，使该微流控电化学生物传感器的检测限极大降低(0.1 fmol/L到1 pmol/L)。Berdat等[29]报道了在微流体通道中使用交叉阵列电极检测1 nmol/L DNA，即将DNA探针固定在交叉状电极之间，与互补的目标DNA链杂交导致电阻增加，然后通过交流阻抗(EIS)测量对应的电荷转移来计算电阻，进而得到目标物的量化信息。

图2 (a)整合了三个通道的PDMS/玻璃POC装置。(1)用于阴性对照的通道，(2)用于检测DNA的通道，(3)错配DNA的检测通道；(b)基于改性二茂铁作为氧化还原标记用于制备生物传感器的化学反应过程(步骤1,2和3)示意图，最终杂交之前每个步骤在流体芯片的通道内完成(步骤4)[29]Fig.2 (a) The PDMS/glass point-of-care device that integrates three channels:(1) Channel for negative control (2) Channel for DNA detection (3) Channel for mismatch DNA detection.(b) Schematic illustration of the chemical patterning(steps 1,2,and 3) for the preparation of the biosensor based on modified ferrocene,as redox marker.Each step is done inside each channel of the fluidic chip before the final hybridization(step 4)[29]

由于微流控通道具有结构多样性，因此可以容纳细胞培养物对细胞进行芯片内的培养，在线分析其分泌物。例如，在微流控体系中结合电化学检测手段可以探究在使用辣根过氧化物酶(HRP)时细胞活动产生的H2O2[30]。Yan等[31]设计了集成的微尺寸Au电极阵列，通过光刻蚀聚乙二醇(PEG)水凝胶形成特定图案，可将HRP分子固定在Au电极上，并控制细胞附着在检测电极的邻近区域，以检测在微流控芯片中培养的活化巨噬细胞释放的H2O2。Matharu等[32]通过研究在芯片中培养的肝细胞产生的电活性氧化物来探索乙醇和抗氧化剂对肝细胞的影响。实时测量细胞分泌物浓度可为细胞培养研究提供相关重要信息，因此，一些研究小组开发了多种方法来检测细胞分泌的信号分子，包括肿瘤坏死因子-α[33],干扰素-γ[34]和转化生长因子-β[35]。Shin等[36]报道了一种新型无标记的微流控电化学生物传感器(图3)，具有独特的内置芯片再生能力，以全自动方式连续测量来自器官培养物细胞分泌的可溶性生物标志物，同时具备较高的传感器灵敏度。该芯片平台持续监测细胞的代谢活性可达7 d，其结果与细胞活力和酶联免疫吸附测定分析结果非常一致，从而验证了这种独特传感平台的准确性。该芯片有13个半圆柱形状的入口微通道(红线)及其对应的控制微型阀(绿线)，用于操控所需试剂和样品的注入，微电极则结合在流动通道的末端(图3a～c)。半圆形流体通道设计实现了控制微阀层对微流控通道的开通与关闭(图3d)，并以程序控制N2气动微阀实现自动化。微型阀和试剂储存器由WAGO控制器控制，编写自定义的MATLAB代码。通过微流控通道和检测器的液体流动的图像如图3e所示，电化学反应腔室中，在液体样品(红色)到达该区域后，逐渐被另一种液体(蓝色)替换，其整个过程需要约5 s(图3f)，每个通道的流速随着通道内压力的升高而增加(图3g)。

图3 自动化微流控电化学生物传感器的设计、制造和控制。(a)与微电极组合的EC微流体芯片的照片；(b)使用相应的溶液标记微流体通道和阀门，实现全自动生物传感测量；(c)三层微流体芯片由流体通道层，薄膜和微阀通道层组成；(d)图示的工作原理是通过气体压力推动薄膜来打开和关闭微流体通道；(e)微流控EC芯片显示在打开和关闭阀门时PBS和检测室的主通道中的颜色随时间变化图；(f)以食品染料验证改变电极区域的化学物质所需的时间；(g)在不同气体压力下测量不同通道的流量(n=3)[36]Fig.3 Design,fabrication,and control of the automated microfluidic EC biosensor.(a) Photograph of the EC microfluidic chip bonded with microelectrode.(b) Labeling of the microfluidic channels and the valves with corresponding flowing solutions for fully automated biosensing measurements.(c) Three-layered microfluidic chip consisted of microfluidic channel,thin membrane,and valve channel layer.(d) Schematically represented working principle to open and close the microfluidic channel by the push-down thin membrane according to gas pressure.(e) Time-lapsed picture of microfludic EC chip showing the color changes in the main channel for PBS and detection chamber upon opening and closing of the valves.(f) Time required for changing the chemicals at the electrode area demonstrated by using food dyes.(g) Measured flow rates at different channels under various gas pressures(n= 3)[36]

2.2 数字微流控(Digital microfluidics,DMF)电化学生物传感

与通道液滴相似的还有一种可以在平面上运动，以离散(单个)控制为基础的数字液滴技术，其中在平面上对样品以离散液滴进行操纵[37 - 40](图1(c))。数字微流控技术的实现依赖于液滴表面的电润湿现象，通过向芯片电极施加电压改变介电质层的固液表面张力，实现液滴的产生、输运和分裂等一系列操作[41]。数字液滴可以通过电子线路直接操作，显示了正在兴起的微流控芯片和已经成熟的电子芯片深度对接的可能。DMF电化学生物传感器特别适用于涉及固体的应用，例如组织[42]、干血[43]、水凝胶[44]、切块[45]，这是DMF的显著优势。事实上，基于DMF实验室芯片的开发，展示了最先进的数字微流控技术在未来的LOC中进行全自动在线生物分析的前景，可成功执行芯片上生物医学体外诊断测定[46]。另外，利用磁力来控制磁性粒子并结合静电控制液滴位置的策略，成为实施免疫测定的有力方法[47 - 51]。

DMF同样是一种用于复杂生物样品测定的强大微流控技术。Wheeler团队[52 - 54]开发了一种基于无油磁粉检测风疹(RV)的免疫分析方法，该方案构建了一个喷墨印刷的DMF装置，并带有电动磁铁的自动化控制系统。图4(a)展示了在此DMF芯片上操作磁性颗粒所涉及的主要步骤：(i)分散颗粒悬浮液；(ii)通过接通磁场固定颗粒并去除上清液；(iii)将颗粒与试剂混合；(iv)将颗粒从反应液中分离并检测最终产物。同一研究小组还将电化学和电化学发光检测器整合到DMF芯片中以检测疾病生物标志物[55 - 56]，如图4(b)所示的双表面检测策略实现对甲状腺刺激激素(TSH)的检测[54]。在该方案中，基于酶联免疫分析(ELISA)，对芯片中心的磁性颗粒表面进行测定，同时在位于DMF两侧的感应电极表面上检测电活性最终产物。这种芯片设计配备多重检测系统，可同时测量4个样品。

之后，Wheeler团队在类似的磁性粒子的分析方法中，通过电化学发光(ECL)检测miRNA以区分乳腺癌表型。在ECL中，[Ru(Phen)3]2+和分析物发生光化学反应，在电极表面形成激发态并产生光辐射，利用光检测器捕获光子并经过计算机处理得到电化学发光信号(图4(c))。此外，Wheeler团队又将金纳米结构(图4(d))建立在电极表面上，以增强伏安响应的灵敏度，通过风疹病毒免疫测定证明该方法的可行性。这种方法的灵敏度低于世界卫生组织定义的风疹免疫值100倍以上，检测限为0.07 IU/mL[55]。

图4 数字微流控芯片上基于磁珠的生物检测。(a)进行基于磁珠的生物检测所涉及的基本步骤：(i)分散功能化磁珠，(ii)通过芯片下方接合的磁体，将上清液与磁珠分离，(iii)将磁珠再与试剂混合，(iv)在方案的最后，与磁珠分离后，操纵最终产物液滴向检测器转移(在这种情况下是电极)[53]；(b)以功能化磁珠进行数字微流控电化学免疫测定，其中液滴中的电活性产物(TMB+)被分离至电极感应区域；(c)磁珠表面DNA探针与目标miRNA杂交形成双链，[Ru(Phen)3]2+可插入该杂交双链，在特定电压下通过电化学发光(ECL)检测DMF上的miRNA[55]；(d)ITO基底上的纳米结构微电极，以增强DMF芯片对电化学免疫测定的灵敏度[55]Fig.4 Magnetic particle based bioassays on digital microfluidic chip.(a) Typical steps involved in performing magnetic bead based bioassay:(i) dispensing of functionalized magnetic particles,(ii) separation of supernatant solution from magnetic particles by engaging magnet beneath the chip,(iii) mixing of particles with reagents,and(iv) moving final product towards detector(in this case electrodes) after separating from beads at the end of protocol[53]；(b) Digital microfluidic electrochemical immunoassay performed over functionalized magnetic beads,where the electroactive end product(TMB+) in the droplet is separated and placed at the electrode sensing area.(c) Detection of miRNA on DMF by electrochemiluminescence(ECL) using DNA probe functionalized beads hybridized with target miRNA followed by intercalation of luminophore [Ru(Phen)3]2+ which emits light under electrical potential[55](d) Nanostructured microelectrodes on ITO top-plate to enhance sensitivity of electrochemical immunoassay on DMF chip [55]

2.3 纸基微流控电化学生物传感

纸基微流控出现的时间较短，2007年哈佛大学的Whitesides研究小组首次提出这一概念，基于液体样品横向流动通过纸基而被动地被吸收(或“泵送”)，成功地制作出同时检测蛋白质和葡萄糖的纸基检测平台[57]，于是这种体系也发展为“微流控”体系中的一种(图1(d))。文献报道的纸基微流控材料有滤纸、层析纸、硝酸纤维素膜等，制作方法涉及光刻法[58]、喷墨打印法[59]、浸蜡法[60]、柔性版印刷[61]等。国内开展纸基微流控的研究团队也取得了较好的成果。陆瑶等[62]在国际上首次提出一种喷蜡打印的方法制作纸基微流控芯片，该方法包括打印和烘烤两部分，可在十分钟之内完成，简便、快速，从而使纸基芯片工业化生产成为可能。纸基微流控由于成本低、制造容易、灵活性高、可处理性强、液体输送不受外部驱动力影响等特点成为研究热点。基于这些优点，使用纸基微流控芯片进行即时诊断(POCT)具有极大的潜力[63]。例如，Yao等[64]开发了一种新型的无标记微流控纸基免疫传感器，用于高灵敏度检测癌胚抗原(CEA)，这种新型纸基微流控平台可以为癌症检测中的低成本、特异性和定点诊断等需求提供实现的可能。Wang等[65]开发了一种无标记的电化学综合纸基免疫传感分析装置，该装置能够检测出低至10 pg/mL的17β-雌二醇，这种微流控纸基免疫传感器为17β-雌二醇的特异性和即时诊断提供了新的平台。尽管取得了这些进展，纸基微流控芯片在定量性能方面落后于其他类型的微流控技术，在选择性、特异性、灵敏度和线性动态范围方面还有待改进[66]。

与纸基微流控结合的电化学生物传感器进一步具有微型化、便携式、即时诊断的特点。Zhao等[67]开发了一种包含八个电化学生物传感阵列的纸基微流控试剂盒，用于同时检测尿液中的葡萄糖、乳酸和尿酸，并利用手持电化学仪(恒电位仪)进行信号读取。该装置由加样区和测试区上的丝网印刷电极组成，直接与恒电位仪集成。将多路复用电路添加到USB控制的恒电位仪上，以便在所有阵列测试点进行检测，检测得到的葡萄糖检测限低至0.35 mmol/L，而商用葡萄糖计的检测限为0.83 mmol/L。该低成本装置显示出在临床相关范围内对这三种分析物有足够低的检测限，并且分析性能可与现有商业纸质平台相媲美。之后，Lamas-Ardisana等[68]开发出一次性电化学纸基葡萄糖生物传感器，用于5种商业软饮料中的葡萄糖测定，分析样品仅需10 μL，无需进行任何样品处理即可得到准确结果，检测限低至0.33 mmol/L，因此提供了大规模生产电化学纸基分析设备(Electrochemical Paper-based Analytical Devices，ePAD)的新方法。Kaur等[69]报道了另外一种纸基微流控电化学生物传感装置，用于即时检测胆固醇。通过简单的石墨掩模印刷得到工作电极以及对电极，以Ag/AgCl作为参比电极来构造三电极系统。共沉淀法制备的氧化镍纳米颗粒对工作电极进行改性，将胆固醇氧化酶滴加在测试区域上，最终借助快速计时电流法可灵敏检测不同浓度的胆固醇。

3 微流控电化学生物传感平台的商业化

微流控电化学生物传感是一种备受关注且具有巨大潜力的科学技术，具有便携式和即时分析的特点。目前来讲，微流控电化学生物传感平台最大的商业化领域还是在体外诊断(In Vitro Diagnosis，IVD)方面。IVD主要是基于体液(血液、尿液、唾液)，有三大类主流分析：生化分析，免疫诊断，分子诊断。国内产品主要还是集中在生化分析和免疫诊断。IVD中做到POCT的最典型的代表为验孕试纸、各种传染类检测试纸、毒品检测试纸等，这些都已成功市场化。国外在生化免疫和分子诊断均有相对成熟的产品，其中不乏重量级代表产品，最著名的例子就是Abbott Point of Care i-STATs系统。位于安大略省渥太华的Abbott Point of Care制造工厂研发的个人血糖仪，每年大约生产5 000多万个，全球价值接近100亿美元[70]。如今，其他微流控电化学POCT产品也相继开发出来，尚在调试阶段，比如类似于手持墨盒用于诊断心脏疾病生物标志物的装置，经济高效的基于智能手机的可重构电化学仪器，用于全血样品中的酒精测定[71]，可以为医疗急救或执法领域提供精确快速的测量点。还有基于电化学生物传感的保健装置也在推行，包括用于HIV诊断的仪器，称为Daktari CD4[72]，以及用于电化学免疫测定和核酸测定的Gene Fluidics台式系统[73]。对比国内外商业化微流控产品，国外微流控产品虽然种类不多，但是均能产生翻倍的商业价值，这也从侧面证明微流控技术具有颠覆性的替代作用。国内微流控产品的商业化相对落后，就IVD医疗器械这方面，国内医疗里的医疗器械与医药消费比还远低于美国这样的医疗体系相对成熟的国家。随着互联网+的战略计划，国内POCT将有很大的发展前景，而互联网+POCT+家庭医疗和个体化健康管理、疾病预防控制、医疗管理等方面将会有井喷式发展机遇。

4 结论及展望

微流控电化学生物传感技术为未来分析行业提供了很好的分析平台，甚至是革命性的新功能。该技术的应用领域非常广泛，涉及环境检测、食品科学、疾病诊断、药物筛选等。在POCT应用方面，将微流控集成到电化学生物传感平台对于便携式系统是一个必不可少的重要趋势[74]。这个趋势包括:(1)发展多个微流控耦合的混合系统，着重于开发新型功能模块及其操作性，低成本和高产量的制造灵敏且廉价的具有良好商业潜力的微流控生物传感器；(2)使用智能检测设备与电化学集成，如智能手机、微电子设备等，其主要优点是可以与许多其他附件集成，例如微型相机，光学系统，电路，加密狗等，为其功能的进一步扩展提供了巨大的可能性[75]。未来的方向应是致力于将微流控芯片和电化学生物传感结合起来，开发样品量少、即时监测、操作简单、成本低廉的快速准确的POCT诊断系统。目前，大多数基于微流控的电化学生物传感系统仍处于实验室标准测试阶段，设计和集成中还需克服一些挑战，因此技术转让和商业化仍有很长的路要走。但是，微流控电化学生物传感作为一个新兴领域，发展速度迅速且蕴含宏观的经济效益，将会是未来重点研究领域。