β -环糊精增敏荧光法测定氟氰戊菊酯

程 杨， 聂继云*， 刘红弟， 闫 震， 匡立学

(中国农业科学院果树研究所，农业农村部果品质量安全风险评估实验室(兴城)，农业农村部果品及苗木质量监督检验测试中心(兴城)，辽宁兴城 125100)

β-环糊精(β-Cyclodextrin，β-CD)，它是直链淀粉在葡萄糖转移酶的作用下生成的环状低聚糖，具有外亲水内疏水的圆筒形中空结构，客体分子的疏水基团能够进入到β-CD的疏水空腔之中，可形成主-客体超分子包合物[1 - 4]，避免去活碰撞，减少分子移动自由度，增加发射速度常数，保持适宜的微环境以及保护激发态不与大体积水分子和猝灭剂接触，从而引起体系荧光显著增强[5 - 7]。近年来，科研工作者已利用β-CD 增敏荧光法来测定蔬菜和水果中农药残留[8 - 9]。氟氰戊菊酯(Flucythrinate)是一种非三元环结构含氟的合成拟除虫菊酯杀虫剂，主要应用于棉花、蔬菜、果树等作物上多种害虫的防治，对叶螨有一定抑制作用。氟氰戊菊酯具有潜在的神经毒性[10]，并且长期接触可能会引起内分泌紊乱等问题[11]。因此，其残留问题必然会给消费者带来潜在的危险并引起人们的高度重视。氟氰戊菊酯的测定方法多为气相色谱法[12 - 13]和气相色谱-质谱联用法[14 - 15]。但这些方法操作繁琐耗时，需要大型仪器和专业操作人员等缺点限制其应用，因此，建立一种氟氰戊菊酯残留快速准确的分析方法显得尤为迫切。

荧光分析法具有实时检测、灵敏度高、分析快速、操作简单、试样用量少等优点，使其在农药残留分析中受到国内外学者的广泛关注，并且在痕量物质的检测方面也具有很好的应用前景[16 - 17]。本文利用荧光光谱法研究了β-CD与氟氰戊菊酯的超分子相互作用，确定了包合比、包合常数，利用其自身产生的荧光信号，通过β-CD对其的增敏作用，可有效降低氟氰戊菊酯的检出限，据此建立一种直接、快速、高灵敏度测定氟氰戊菊酯含量的新方法，为β-CD作为超分子主体化合物对客体分子的荧光增敏效应提供理论基础。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

F-4600型荧光光谱仪(日本，日立公司)；雷磁pHS-3E型数显式pH计(上海仪电科学仪器有限公司)；VT6060M真空干燥箱(美国，赛默飞世尔科技公司)。

β-环糊精(β-CD)(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；氟氰戊菊酯标准品(农业农村部环境保护科研监测所)，二次重结晶，真空干燥后备用；其它试剂均为分析纯。所有实验用水均为高纯水。

1.2 溶液的配制

氟氰戊菊酯标准溶液:准确移取1 mL 100 μg/mL氟氰戊菊酯标准品溶液，用95%乙醇稀释100 mL，然后再稀释成0.1 μg/mL的标准工作溶液。β-CD溶液:准确称取2.8375 gβ-CD，用高纯水配制成浓度为1.0×10-2mol/L贮备溶液。B-R缓冲溶液:取0.272 mL 85%H3PO4，0.464 mL 36%冰HAc和0.2473 g H3BO3，用高纯水配成100 mL的三酸混合液(0.04 mol/L)；将配制好的三酸混合溶液与不同体积NaOH溶液(0.2 mol/L)混合，可得到不同pH的B-R缓冲溶液。

1.3 实验方法

移取1 mL 0.1 μg/mL的氟氰戊菊酯标准工作液，置于10 mL比色管中，依次加入不同体积的β-CD(1.0×10-2mol/L)的标准溶液，1 mL的B-R缓冲溶液(pH=5.02)，加高纯水稀释至刻度，充分摇匀，室温下放置5 min后，在λex=251 nm，λem= 306 nm的条件下测定溶液的荧光强度。

2 结果与讨论

2.1 氟氰戊菊酯的荧光激发和发射光谱

按照实验方法，在室温下进行荧光激发光谱和发射光谱的扫描，扫描波长200～700 nm，扫描速度为2 400 nm/min。最后确定氟氰戊菊酯的λex=251 nm，λem=306 nm，仪器狭缝宽度均为2.5 nm。

2.2 pH值对氟氰戊菊酯荧光强度的影响

采用B -R缓冲溶液考察了pH=1.98～11.20范围内反应体系荧光强度的变化。由图1可以看出，β-CD包合氟氰戊菊酯的荧光强度在pH为1.98～6.09范围内较为稳定，当体系pH=5.02时，荧光强度达到最大值。本实验选择pH=5.02作为体系荧光测定的最佳pH值，B-R缓冲溶液用量为1 mL。

2.3 氟氰戊菊酯与β -CD反应时间对其荧光强度的影响

取按实验方法配制溶液8份，测定反应不同时间的后荧光强度。氟氰戊菊酯与β-CD的反应在5～40 min内，体系的荧光强度变化不大。实验选择反应时间5 min为最优实验条件。

2.4 β -CD浓度对氟氰戊菊酯荧光强度的影响

在pH=5.02条件下，固定氟氰戊菊酯的浓度，分别加入不同体积的β-CD。实验结果表明，氟氰戊菊酯的荧光强度随着β-CD浓度的增加而增强(图2)，当加入1.0×10-2mol/Lβ-CD溶液体积达到4 mL时，氟氰戊菊酯荧光强度的增加趋于平缓并达到最大值，这是由于β-CD对氟氰戊菊酯的包合作用所致。本文选择1.0×10-2mol/Lβ-CD的加入量为4 mL。

图1 溶液pH对荧光强度的影响Fig.1 The effect of pH on the fluorescence intensity

图2 β -CD的加入量对于荧光强度的影响Fig.2 The effect of the amount of β -CD on the fluorescence intensity[β -CD]:1.0×10-2 mol/L.1-7:1 mL，1.5 mL，2 mL，2.5 mL，3 mL，3.5 mL，4 mL.inset:Relationship equation curve of β -CD-flucythrinate inclusion complex.

在本实验中，我们利用Benesi-Hildebrand的双倒数法测定β-CD包合常数，根据公式[8]，将所得实验数据按1/(F-F0)对1/[CD]作图，可得线性关系较好的直线:y=2.36923×10-4x+0.0351(R2=0.9985)。实验结果表明β-CD与氟氰戊菊酯之间形成了1∶1的超分子包合物。由直线的截距与斜率之比可求得(图2内插图):β-CD与氟氰戊菊酯的结合常数K=148 L/mol。

图3 β -CD与氟氰戊菊酯形成包合物的模型Fig.3 A model for the formation of inclusion complexes of β -CD and flucythrinate

由于氟氰戊菊酯的疏水基团在疏水作用、氢键力及范德华力等非共价键作用的驱动下，进入β-CD疏水空腔形成主-客体包合物，从而导致β-CD对氟氰戊菊酯具有荧光增敏作用，β-CD的空腔尺寸大小与极性对客体分子氟氰戊菊酯进行选择性识别包合。这种结构模型(图3)导致氟氰戊菊酯分子的荧光在β-CD疏水空腔中受到屏蔽和保护，减少分子的移动自由度，避免分子间的去活碰撞，体系的荧光强度增加。

2.5 干扰实验

2.6 工作曲线、检出限及精密度

在实验选定的最优化条件下，改变氟氰戊菊酯的加入浓度，按照实验方法绘制标准曲线。实验结果表明，氟氰戊菊酯的浓度在1～30 ng/mL之间与其荧光强度呈现良好的线性关系(R2=0.9975)，线性回归方程为:y=4.65x+36.99，计算方法检出限(3σ/k)为0.25 ng/mL。对20份浓度为0.01 μg/mL的氟氰戊菊酯标准溶液平行测定，其相对标准偏差(RSD)为1.3%。

2.7 实际样品分析

分别称取市售苹果18.95 g，梨13.28 g，分别切成小块研磨后，用50 mL 95%乙醇浸泡，过滤后转移至50 mL容量瓶中定容后作为样品溶液。按照实验方法，在2支10 mL比色管中分别加入1 mL苹果和梨样品溶液，再取另外两支10 mL比色管，分别加入1 mL苹果和梨样品溶液和1 mL浓度为0.1 μg/mL的氟氰戊菊酯标准溶液进行测定，平行测定5次(表1)。从表1结果可以看出，我们建立的基于β-CD荧光光谱法具有很好的测定值和回收率，说明此方法可以应用于水果中氟氰戊菊酯的快速检测。

表1 水果样品分析结果(n=5)

3 结论

本文通过β-CD增敏荧光光谱法测定水果中氟氰戊菊酯的含量，该方法的线性范围为1～30 ng/mL，检出限为0.25 ng/mL，RSD为1.3%。建立的荧光检测方法，具有灵敏度高，选择性好，操作简便等优点，能够满足水果中氟氰戊菊酯的检测要求，尤其适用于小型实验室的应用研究，对水果中农药残留的检测有一定的参考价值。