与抗结核药物肝损伤易感性相关的基因多态性研究进展

赵德芳，董 勤

(内蒙古医科大学附属医院肝胆外科，呼和浩特 010050)

结核病是一种传染性疾病，由结核分枝杆菌感染引起。其主要影响患者肺功能，也可以引起全身多脏器疾病。结核病在全球致死原因中占第九位[1]。世界卫生组织数据显示，2016年全球有1 040万人新诊断为结核病，有130万人因结核病而死亡[2]。为应对这一全球性公共卫生问题，临床结核病的标准治疗方案为多种抗结核药(异烟肼、利福平、吡嗪酰胺等)联合使用[3]。而抗结核药物治疗过程中出现的抗结核药物肝损伤(anti-tuberculosis drug induced liver injury, AT-DILI)严重干扰了抗结核治疗方案的进行。相关数据显示，与未发生肝损害的患者相比，我国AT-DILI患者治疗强化期延长的风险增加2.11倍，治疗失败风险增加9.25倍[4-6]，且抗结核药物引起的肝损害可导致不可逆转的肝功能衰竭[7]。因此，AT-DILI成为结核病患者广泛关注的问题。但其发生很难预测，许多原因可导致AT-DILI，包括遗传(遗传变异)、生理(年龄和性别)、病理(肝脏疾病)和环境因素(膳食化合物)等。因此，对与AT-DILI相关的遗传因素进行研究具有重要的临床意义。现就与AT-DILI易感性相关的基因多态性研究进展予以综述。

1 药物性肝损伤产生的机制

药物性肝损伤受药物代谢特点和代谢过程的影响。药物性肝损伤三步工作模式阐明了其发生机制[8](图1)：①原药(或其代谢产物)通过细胞应激、抑制线粒体功能、免疫调节等引发肝损伤，在此过程中药物代谢酶与转运蛋白的基因发生变异会引起药物代谢的变化，从而增加药物性肝损伤的风险。②第一步引起的初步肝损害通过内在途径(细胞促凋亡蛋白的激活、应激级联反应等)或外在途径[被免疫反应激活、受细胞因子调节、对肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)敏感]引起线粒体通透性转换，相关免疫蛋白的基因变异可能会对药物性肝损伤的发生风险产生影响。③线粒体通透性转换增强会使氧化应激反应进一步增强，从而引起肝细胞凋亡或坏死。因此，与氧化应激反应相关基因的突变可能会对药物性肝损伤的发生风险产生影响。

图1 药物性肝损伤的发生机制

2 AT-DILI的特定分子机制

目前，异烟肼引起的肝损伤机制较为明确[9]。其进入肝脏后，被N乙酰基转移酶2(N-acetyltransferase 2，NAT2)乙酰化为乙酰异烟肼，也可直接水解为异烟酸和肼，其中乙酰异烟肼和异烟酸无毒，肼有毒[10]。异烟酸可直接与甘氨酸结合排出体外，而乙酰异烟肼和有毒的肼继续被NAT2乙酰化生成乙酰烟肼[11]。乙酰烟肼可继续被NAT2乙酰化生成无毒的二乙酰肼，也可经细胞色素P450(cytochrome P450，CYP450)代谢生成乙酰偶氮、烯酮、乙酰阳离子等有毒物质，这些有毒物质须经谷胱甘肽硫转移酶(glutathione S-transferase，GSTs)催化，与谷胱甘肽共价结合才能排出体外[12]。因此，在异烟肼代谢过程中，NAT2、CYP450和GSTs功能的改变可能会引起AT-DILI。目前，利福平与吡嗪酰胺的具体发病机制尚未明确[13]。但研究表明，利福平和异烟肼均可引起肝细胞损害[14]。

3 基因多态性与AT-DILI易感性

与AT-DILI相关的蛋白质主要包括：①药物代谢酶(NAT2、CYP450、羧酸酯酶1和GSTs)；②与胆汁酸、脂质和血红素代谢物积聚有关的蛋白质[胆固醇7α-羟化酶(cholesterol 7α-hydroxylase,CYP7A1)、胆盐输出泵(bile salt export pump，BSEP/ABCB11)、溶质运载蛋白家族(solute carrier family,SLC)、葡萄糖醛酸转移酶(UDP-glucuronosyl transferases,UGTs)、孕烷受体(pregnane receptor，PXR)]；③与免疫应激有关的蛋白质[人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)、TNF-α、白细胞介素(interleukin，IL)6、信号转导及转录激活因子3(signal transduction and activator of transcription 3，STAT3)]；④与氧化应激相关的蛋白[GSTs、硫氧还蛋白还原酶1(thioredoxin reductase 1，TXNRD1)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)1、核因子E2相关因子2-抗氧化反应元件(nuclear factor erythroid-2 related factor 2-antioxidant response element，Nrf2-ARE)]。见图2。

CYP：细胞色素P450；CES1：羧酸酯酶1；NAT2：N乙酰基转移酶2；GSTs：谷胱甘肽S转移酶；CYP7A1：胆固醇7α-羟化酶；BSEP：胆盐输出泵；SLC：溶质运载蛋白家族；UGTs：葡萄糖苷酸转移酶；PXR：孕烷受体；TXNRD1：硫氧还蛋白还原酶1；SODs：超氧化物歧化酶；Nrf2-ARE：核因子E2相关因子2-抗氧化反应元件；HLAs：人类白细胞抗原；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；IL-6：白细胞介素-6；STAT3：信号转导及转录激活因子3

图2 与AT-DILI相关的蛋白

3.1药物代谢酶与AT-DILI易感性

3.1.1Ⅰ相代谢酶 CYP450家族为AT-DILI最主要的Ⅰ相代谢酶。研究表明，CYP2B6、CYP2C19、CYP2E1、CYP3A4、CYP3A5与AT-DILI的发生均有密切联系[15]。此外，羧酸酯酶1也影响AT-DILI的发生。CYP2E1基因转录起始点上游有两个多态性位点(RsaI位点和PstI位点)表现出连锁不平衡。CYP2E1基因野生型为CYP2E1*1A，相关等位基因“C1”由RsaI(+)和PstI(-)组成；突变型为CYP2E1*5，相关等位基因为“C2”，由“C1”中任意一点发生变异，即RsaI(-)或PstI(+)所得[16]。CYP2E1*6s是CYP2E1基因内含子上的一个位点，可被限制性内切酶DraI识别，其表现型有野生型TT、纯合突变型AA和杂合突变型TA。此外，位于基因5′端的CYP2E1*1D/*1C也影响着基因的调控[17]。CYP2E1等位基因与AT-DILI之间的联系已在不同的人群中进行了广泛研究。结果表明，CYP2E1c1/c1基因型具有较高的酶活性，可增加AT-DILI的发生风险[18-19]。动物实验也表明，在异烟肼和利福平进行联合治疗前，用CYP2E1抑制剂治疗的小鼠肝损伤较轻[20]。

除CYP2E1外，还有其他几种CYP酶基因的多态性与AT-DILI的发生有关，如CYP2B6、CYP2C19、CYP3A5、CYP3A。其中，CYP2B6(rs3745274)基因中的G516T多态性与AT-DILI的易感性有关，当发生TT纯合突变时，AT-DILI发生的可能性更大[21]。快代谢型CYP2C19发生AT-DILI的风险低[22]，且存在一定的地域差异[23]。CYP3A5*3、CYP3A4*18B两个位点突变可能升高AT-DILI的发生风险，且与均不突变相比，CYP3A5*3单一突变也可能升高AT-DILI的发生风险[23]。

羧酸酯酶1在代谢过程中发挥重要的催化作用，其承担着内源性和外源性物质酯、硫酯、酰胺键的水解和酯交换反应[13]。羧酸酯酶1在肝内表达，参与异烟肼的代谢过程。Yamada等[21]发现，羧酸酯酶12基因-2位点C/G变异在英国人群中影响羧酸酯酶1基因的起始翻译。吴雪琼等[22]发现，rs8192950 AC基因型和rs1968785 GG基因型在中国人群中是AT-DILI的保护因素。

3.1.2Ⅱ相代谢酶 Ⅰ相反应产生了一系列肝细胞毒性产物，需要Ⅱ相反应解毒，Ⅱ相反应解毒过程需要特异性转移酶的参与，而特异性转移酶基因多态性会影响酶活性，当酶活性发生改变时，会影响AT-DILI的发生。

NAT2参与外源性物质的乙酰化。其等位基因分为慢乙酰化等位基因(NAT2*5 NAT2*6 NAT2*7NAT2*14)和快乙酰化等位基因(NAT2*4、NAT2*11、NAT2*12、NAT2*13)[11,23]。依据单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)多态性，NAT2基因分为慢乙酰化基因型、快乙酰化基因型、中间乙酰化基因型[24-25]。国外相关研究发现，NAT2慢乙酰化基因型会增加AT-DILI的发病风险[26-28]，与国内研究结论一致[29]。动物实验发现，慢乙酰化基因型小鼠异烟肼的慢乙酰化代谢产物可与机体内的某些物质(脂肪酸、维生素B6)有交互作用[30]。

GSTs可以防止氧化应激对细胞造成的损伤。其通过促进抗结核药物的中间代谢产物与谷胱甘肽结合，使之排出体外，从而达到解毒的作用。因此，肝细胞缺乏GSTs会增加AT-DILI的发病风险。与AT-DILI发病相关的基因型主要为GSTM1和GSTT1。在印度人群中发现，GSTM1纯合子缺失基因型AT-DILI风险系数高[31]。而在西班牙人群中的研究提示，AT-DILI与GSTM1无显著联系[30]，安慧茹[31]、黄倩等[32]的研究也得出类似结论。祖丽娅·沙塔尔等[33]的研究虽然没有发现单独GSTT1基因型与AT-DILI的关系，但发现了GSTM1、GSTT1同时缺失基因型会影响AT-DILI 的发生。关于GSTs与AT-DILI的关系，国内外研究结果不一，这可能与地域、民族、样本量等差异有关，因此需要更多的研究去验证GSTs与AT-DILI 之间的关系。

3.2代谢产物转运蛋白与AT-DILI易感性 AT-DILI的发生可影响肝脏的正常代谢功能，导致相关代谢产物在肝内的积聚，如胆汁酸、脂肪酸和含铁血黄素，从而进一步损伤肝脏。与代谢产物积聚有关的蛋白质主要有CYP7A1、BSEP/ABCB11、SLC、UGTs、PXR。与编码这些蛋白相关的基因发生突变会影响AT-DILI的发生与发展。

CYP7A1催化胆固醇在肝脏分解为胆汁酸[34]。一项研究数据表明，CYP7A1SNP (rs3808607)与结核感染密切相关[35]。另有研究发现，CYP7A1基因多态性影响AT-DILI的发生[36]。动物实验表明，CYP7A1的高表达促进胆汁酸的高分泌，从而增加肝损害[37]。

BSEP是肝细胞分泌胆汁酸的运载体，BESP蛋白的表达可影响胆盐分泌、改变胆汁的形成，导致胆汁淤积甚至胆结石的形成，其基因多态性影响相关蛋白表达，可能对AT-DILI 的发生起作用[38]。

SLC转运体的主要作用是参与肝细胞摄取肝血窦中外源性化合物，同时也可参与结合型胆汁酸的调控，其调控可分为非钠依赖性途径和钠依赖性途径。前者主要为有机阴离子转运蛋白和由SLC01B1编码的有机阴离子转运多肽家族的成员；后者主要为SLC10A1编码的牛磺胆酸钠共转运多肽。抗结核药物进入肝脏后，需要从肝血窦进入肝细胞进行代谢，而有机阴离子转运多肽可将药物从肝血窦转移到肝细胞中，所以编码有机阴离子转运多肽的基因SLC0B1发生突变，会影响药物的药动学。SLC01B1基因521位点T>C突变，会增加AT-DILI的发病风险[39]。此外，SLCO1B1*15单倍体与AT-DILI患病风险增加有关[38]。

UGTs是外源物质在生物体内进行Ⅱ相代谢的生物转化酶。体内游离的胆红素为脂溶性，不能被肾小球滤过。游离胆红素在UGTs的作用下与葡萄糖酸结合，形成水溶性的结合胆红素，从而可通过尿液排泄。在肝脏表达的UGTs主要为UGT2B7，且存在于UGT2B7基因编码区和启动子区的基因多态性与遗传易感性密切相关，UGT2B7-268、802位点基因多态性会增加AT-DILI的发病风险，且野生型携带者发生AT-DILI的风险明显高于802位点突变型纯合子TT携带者和UGT2B7基因268位点突变型杂合子AG携带者[40]。此外，UGT1A1*27和UGT1A1*28的基因多态性也与AT-DILI的发生有关[41]。

PXR是重要的核受体，其能够调节药物代谢酶基因的表达。PXR(rs2461823和rs7643645)遗传多态性增加了AT-DILI的发生风险[42]，其中PXR(rs7643645)基因突变可能通过降低肝细胞核因子4α的亲和力来抑制PXR，从而影响AT-DILI[43]。动物实验发现，大鼠PXR激活剂能增强异烟肼导致的大鼠肝毒性，其机制可能与激活剂上调CYP3A的活性有关[44]。

3.3免疫因子与AT-DILI易感性 免疫反应可通过外在途径引起线粒体通透性转换，从而引起肝细胞凋亡或坏死。与AT-DILI相关的免疫因子主要有HLAs、TNF-α、IL-6/STAT3通路。

3.3.1HLAs HLAs是一种编码主要组织相容性复合体的表达产物。HLA基因被分为主要组织相容性复合体Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三种。其中，主要组织相容性复合体Ⅰ型基因包括HLA-A、HLA-B和HLA-C，主要组织相容性复合体Ⅱ型基因包括HLA-DQA1/B1和HLA-DRA1/B1。当主要组织相容性复合体基因正常时，药物蛋白不触发抗原呈递细胞。然而当HLA基因发生突变时，抗原呈递细胞表面发生变化，药物蛋白激活抗原呈递细胞，从而激活T细胞导致肝细胞损伤反应。许多研究发现了HLAs基因多态性与AT-DILI发病之间的相关性，HLA-DQB1* 05/*05基因型可增加AT-DILI的发病风险[45]，且AT-DILI患者HLADQA1*03∶02、HLA-DRB1*08∶01或HLA-DQB1*08∶03的等位基因频率高于非AT-DILI人群[46]。

3.3.2TNF-α TNF-α是一种具有广泛生物学活性的炎症因子，由单核巨噬细胞产生，在药物引起的免疫反应中起重要作用。TNF-α转录起始点上游的308G/A突变可使TNF-α水平升高[47]。动物实验发现，异烟肼组的TNF-α信使RNA和蛋白表达随灌胃时间的延长逐渐升高[48]。因此，抗结核药物可通过影响TNF-α的转录过程，影响TNF-α蛋白的表达，从而影响AT-DILI 的发生与发展。

3.3.3IL-6/STAT3信号通路 IL-6/STAT3通路是调节肝脏细胞再生的重要通路。IL-6是一种具有调节细胞增殖和分化、调控炎症反应、免疫防御等多种生物功能在内的常见细胞因子。STAT3是一类重要的转录因子，参与细胞信号转导和转录激活。生长因子、干扰素等多种外源性信号刺激可激活JAK-STAT3信号通路，从而调控下游诸多靶基因的表达，参与免疫调节及细胞的增殖、分化、凋亡等生物学过程。在肝脏中，IL-6可以激活STAT3信号通路，调控下游靶基因(Bcl-2、Bcl-xL、Fas相关死亡域样白细胞介素-1β转换酶抑制蛋白等)活化，进而阻断Fas/Fas配体诱导的细胞凋亡途径，发挥保护肝脏的作用[49]。其中，IL-6/STAT3信号通路中IL-6基因SNPrs2066992和STAT3基因SNPrs1053023与AT-DILI的发生有关[50]。

3.4氧化应激酶及氧化应激因子与AT-DILI易感性 肝细胞中的氧化应激反应最终会引起肝细胞的凋亡或坏死。与AT-DILI相关的氧化应激途径有TXNRD1、SODs、Nrf2-ARE信号通路。

TXNRD1是一种抗氧化应激的关键酶，是硫氧还蛋白和二氧化硒的主要代谢酶，可保护细胞免受氧化应激损伤。研究表明，TXNRD1基因中有几个SNP位点均与药物引起的肝损伤发展有关，包括抗结核药物、抗生素和抗癫痫药物[51]。另有研究也发现，TXNRD1基因多态性与AT-DILI易感性相关[52]。

SODs可将活性氧类代谢为过氧化氢，在药物代谢中发挥解毒作用。在过氧化氢酶的作用下，过氧化氢又可被过氧化氢酶和过氧化物酶代谢生成水，因此SOD具有抗氧化应激作用。研究发现，SNP rs2070424与AT-DILI显著相关[53]。有学者在国内人群中发现，AT-DILI患者SODs基因47位C/C基因频率明显升高[54]。动物实验发现，抗结核药物治疗后，SD大鼠肝脏匀浆的SODs水平显著降低，造成肝脏代谢负担明显加重，肝脏毒性亦随之增加[55]。

Nrf2-ARE信号通路氧化应激是许多肝脏疾病发生的共同机制。Keap1是亮氨酸拉链家族中调节氧化应激反应的重要转录因子Nrf2的特异性受体。在正常生理状态下, Keap1通过与Nrf2 的N端特异性结合，抑制Nrf2的活性，此时细胞内抗氧化物和Ⅱ相酶类处于基础表达水平，细胞状态稳定。而活性氧或其他亲电试剂刺激会使Keap1与Nrf2解偶联，Nrf2转移进入细胞核，与核内小Maf蛋白结合，形成异二聚体。异二聚体识别并结合ARE，进而启动下游Ⅱ相解毒酶基因和抗氧化保护性基因的转录，包括还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸醌氧化还原酶、血红素加氧酶1、环氧化物水解酶、GSTs和谷氨酸半胱氨酸连接酶等，见图3。机体和细胞在这些酶的保护下可免受活性氧类及一些毒性物质(致癌物、药物活性代谢产物等)的侵害。此外，磷脂酰肌醇-3-激酶、促分裂原活化的蛋白激酶、蛋白激酶C也可激活该通路，这主要由于Nrf2的丝氨酸和苏氨酸残基可被酪氨酸蛋白激酶磷酸化，从而使Nrf2与Keap1解偶联，Nrf2转位入核，结合ARE激活Nrf2-ARE信号通路[56]。

在Nrf2-ARE信号通路中，MAFK基因rs4720833GA或AA基因型、一氧化氮合酶2A基因rs110800344CC基因型及BTB-CNC异体同源体基因rs2070401CC基因型是导致AT-DILI发生的独立危险因素。目前，药物途径和基因途径两种主要途径可以激活Nrf2-ARE信号通路。其中，Keap1-KO、Keap1-CKO以及Keap1-KD是Nrf2的主要基因激活途径。研究发现，腹腔注射高剂量(700 mg/kg)对乙酰氨基酚会使Keap1-CKO小鼠肝脏中的Nrf2及其下游靶基因谷氨酸半胱氨酸连接酶、GSTs、NAD(P)H 醌氧化还原酶1的表达明显增加，可抵制对乙酰氨基酚引发的肝脏毒性[57]。

Nrf2：核因子E2相关因子2；ARE：抗氧化反应元件；HO-1：血红素氧化酶；NQO1：NAD(P)H 醌氧化还原酶1；GCL：谷氨酸半胱氨酸连接酶；GST：谷胱甘肽硫转移酶；EH：环氧化物水解酶

图3 Nrf2-ARE信号通路

4 小 结

结核病是一个全球性的公共卫生问题，世界上每年有1 000多万人受到结核病的影响。抗结核药物的联合使用可以有效控制结核的病情发展。然而，这种联合疗法也会导致严重的不良反应。药物代谢酶、代谢产物转运蛋白、免疫因子、氧化应激酶及氧化应激因子多种基因的多态性与AT-DILI易感性有关。其中，CYP2E1、NAT2基因多态性影响着AT-DILI的发生；虽然对GSTs相关基因多态性的研究也很多，但结果不一，这可能与地域、民族、样本量等的差异有关。目前，对与胆汁酸、脂肪酸、血色素等代谢产物积聚、氧化应激、免疫反应相关的基因多态性研究较少，未来需开展大样本、多种族、多中心的风险评估研究，进一步研究其与AT-DILI易感性的关联，以指导临床用药，调整不同基因型个体用药方案，从而预防AT-DILI的发生。