西兰花种子中黑芥子酶酶解性质及其应用研究

侯海亮, 邓 莉, 杨 黾, 刘 娜

(1.天津春发生物科技集团有限公司 研发中心, 天津 300399;2.天津市风味食品配料企业重点实验室, 天津 300399)

黑芥子苷/黑芥子酶体系是十字花科植物中普遍存在的酶促反应体系。该体系产生的异硫氰酸酯盐，不但具有驱虫、杀虫及抑制土壤微生物的功效[1-4]，还具有防癌[5-7]和抗菌[8-11]等功效，拥有广阔的市场前景。大多研究者研究的是黑芥子酶的药用价值[12-15]，对黑芥子酶在食品催化方面的应用鲜有报道。本文对黑芥子酶在催化脱水蔬菜方面的应用进行了初步研究，旨在为黑芥子酶在食品方面的进一步研究和应用提供参考。

受保存时间过长或加热等多方面因素影响，生蔬菜、脱水蔬菜及熟制蔬菜等菜品会损失很多异硫氰酸酯类物质，进而失去原有的独特风味。这是因为，蔬菜的内源黑芥子酶容易在保存的过程中失活，不能进一步催化食品中黑芥子苷转化成具有特殊风味的异硫氰酸酯类物质。不同的十字花科植物拥有不同种类、不同含量的异硫氰酸盐，若应用某种异硫氰酸酯类物质对菜品进行调香，会产生明显的不和谐风味。黑芥子酶的酶活性、种类及数量对异硫氰酸酯的生成量均会产生很大的影响，黑芥子酶活性受pH值、温度等多种因素的制约[16]。本研究拟采用天然植物西兰花种子中的内源酶作为天然酶，催化蔬菜中黑芥子苷生成异硫氰酸酯类等特殊风味物质。该方法可以使十字花科的生蔬菜、脱水蔬菜及熟制蔬菜散发出特有的香气。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

西兰花种子、油菜籽饼粕及蔬菜皆购自农贸市场；脱水蔬菜为兴化市福味食品有限公司生产；二氯甲烷、石油醚、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸等试剂均为分析纯，购自天津市风船化学试剂有限公司；异硫氰酸烯丙酯(分析纯)，购自Sigma公司。

1.2 仪器与设备

HP1200型高效液相色谱、6890N GC-5975 MSD型气相色谱- 质谱仪，安捷伦科技(中国)有限公司；85- 2型磁力搅拌器，天津市华仪鑫达仪器仪表有限公司；DZF- 6020型恒温真空干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；PL403型电子天平、FiveEasy Plus型pH检测器，梅特勒- 托利多(常州)精密仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1粗黑芥子酶提取物的制备

将西兰花种子用研钵磨碎、过筛，转移至烧瓶。在烧瓶中倒入一定量的石油醚，使石油醚刚好浸过种子粉。过夜脱脂，反复进行3次。将脱脂后的西兰花种子放入恒温真空干燥箱中，20 ℃下挥去石油醚，即可得到粗黑芥子酶的提取物。

1.3.2异硫氰酸烯丙酯含量的测量

取一定量的标准品，用pH值为7的磷酸二氢钾- 磷酸缓冲溶液定容至100 mL，取样量为10 μL，液相色谱柱采用Agilent Eclipse XDB- C18 色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为V(甲醇)∶V(水)=60∶40；流速1 mL/min；柱温30 ℃；紫外检测波长247 nm[17]。进行检测，绘制标准曲线。

1.3.3黑芥子酶酶活性测定

准确称取100 mg粗黑芥子酶提取物样品，油菜籽饼粕1 g，加入20 mL pH值为7的磷酸氢二钾- 磷酸缓冲溶液， 40 ℃磁力搅拌酶解2 h，再加入2 mL二氯甲烷萃取。将离心管5 000 r·min-1条件下离心5 min，取10 μL二氯甲烷清液过滤，进样检测。采用1.3.2中检测异硫氰酸烯丙酯的方法测定由酶解生成的异硫氰酸烯丙酯的含量。

黑芥子酶活的定义为40 ℃、pH值为7的条件下，单位时间(h)转化催化1 μmolβ-硫代葡萄糖苷所需要的酶量，为1 U。黑芥子酶酶比活力定义为单位质量(mg)粗酶提取物中，在单位时间(h)转化催化1 μmolβ-硫代葡萄糖苷所需要的酶量，为1 U/mg。

1.3.4西兰花黑芥子酶催化实验

准确称取1 g某种蔬菜及0.1 g 100目西兰花种子粉放置于西林瓶中，再加入10 mL水密封，作为2号瓶。1号瓶为只有等量的种子粉末及蒸馏水的对照组，3号瓶为只有等量的蔬菜及蒸馏水的对照组。同一条件下，检测挥发性物质的含量，对比参照是否有含量变化。吸附完成后打开瓶盖，评香员进行感官评价、打分。

1.3.5挥发性风味物质的测定

1)气相色谱条件：载气为He，不分流，流速1.0 mL·min-1，进样口处的温度为250 ℃，程序升温模式，起始温度为40 ℃，保持8 min。以5 ℃·min-1的速率加热气相色谱柱，上升至140 ℃，保持3 min；再以10 ℃·min-1的速率加热气相色谱柱，上升至250 ℃。

2)质谱条件：全扫描模式，EI离子源，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，质量扫描范围m/z为35～500 u，无溶剂延迟。

3)固相微萃取条件：于50 ℃磁力搅拌器上吸附40 min。

2 结果与讨论

2.1 不同因素对黑芥子酶活性的影响

2.1.1不同品种西兰花种子对黑芥子酶活性的影响

在温度为40 ℃，pH值为7的缓冲溶液实验条件下，对不同品种的西兰花种子黑芥子酶酶活性测量，结果见表1。由表1可以看出，成熟期为早中熟的西兰花种子在40 ℃时酶活性最高，酶比活力为40 U·mg-1左右；中熟型与中晚熟型的酶活性其次，为31～33 U·mg-1；晚熟型西兰苔1号(西兰苔)酶比活力为25 U·mg-1。

表1 10种西兰花种子的酶活性差异Tab.1 Differences of myrosinase activity from 10 broccoli seeds

2.1.2温度对黑芥子酶活性的影响

选取4种不同成熟期类型的西兰花种子，在pH值为7，不同温度下对黑芥子酶的酶活性进行检测，将结果绘制成图1。由图1可见，不同品种间的酶活性差异较大：文兴、炎秀种子在50～60 ℃时，黑芥子酶酶活性最高；西兰苔种子则在55～65 ℃时黑芥子酶酶活性最高；碧玉种子则在50～55 ℃时黑芥子酶酶活性最高，但整体差异不大。这4种西兰花种子在50～65 ℃时均能体现出很好的催化效率，其中有两种西兰花种子在55 ℃时催化效率最高。

图1 温度对不同品种西兰花种子中黑芥子酶活性的影响Fig.1 Effects of temperature on myrosinase activity in different kinds of broccoli seeds

2.1.3pH值对黑芥子酶活性的影响

选取文兴、西兰苔、炎秀及碧玉4种西兰花种子作为黑芥子酶的供体，采用磷酸氢二钾- 磷酸的缓冲溶液，选择pH值为4、5、6、7、8、9六个值为测试点，选择50 ℃作为酶解温度，对黑芥子酶的酶活性进行测量，结果见图2。由图2可知，不同pH值，酶活性差异较大。碧玉、炎秀种子中黑芥子酶最适pH值为5～7；文兴、西兰苔种子酶活性最高时的pH值为6～8。在pH值为6时，碧玉西兰花中的黑芥子酶酶活性最高，其次才是文兴西兰花，但是碧玉西兰花的酶活性较高的位置在弱酸环境，而文兴和西兰苔两种西兰花的黑芥子酶酶活性最高区域则在酸碱中性附近。

图2 pH值对不同品种西兰花种子中黑芥子酶活性的影响Fig.2 Effects of pH on myrosinase activity in different kinds of broccoli seeds

2.1.4保存状态对黑芥子酶活性的影响

经过实验对比，选取酶活性最高、酸碱适应性最强的文兴西兰花种子做保存状态对黑芥子酶影响的实验。由于测量酶活性的目的是应用于可食用的菜品，所以需要考虑使用方法、食品安全及保质期长短3个方面的因素。西兰花种子需粉碎筛选后进行酶活性测试，作为对照组；脱脂前与脱脂后的种子粉末作为实验组，进行长达一年的跟踪实验，结果见图3。由图3可见，脱脂之后的酶比活力比未脱脂及种子的酶比活力要高，可能是因为单位质量的酶的数量较多，使得酶比活力较高。随着时间的变化脱脂的种子粉末酶比活力会降低，而没有粉碎的种子及未进行脱脂的种子的酶比活力随着时间的变化不大。因为脱脂过程采用石油醚，操作比较繁琐且有残留；而未粉碎的种子不能直接食用，所以粉碎后筛选未进行脱脂的种子粉末才能作为天然无污染的外源酶，对食品进行风味改良。

图3 不同状态下的文兴西兰花种子酶活性变化趋势Fig.3 Change trends of myrosinase activity in Wenxingbroccoli seeds at different state

2.2 西兰花黑芥子酶催化实验结果

经过实验对比及2.1的结果分析，优选出未脱脂的文兴西兰花种子进行蔬菜的香气催化实验。以脱水甘蓝菜为例，直接按照实验1.3.4进行固相微萃取操作，然后进行GC/MS检测，结果见图4。由图4可见，反应前后4-甲硫基戊腈峰面积基本不变。以4-甲硫基戊腈为参照可以看出，反应后的异硫氰酸脂类比例明显升高，峰面积明显增大，尤其是异硫氰酸烯丙酯的含量迅速增加。按峰面积粗略估计，增大的比例约为400%，相比之下，种子粉末对照组的峰面积几乎为0。感官评价结果中，只有种子的1号瓶气味很小，可忽略不计，设定3号瓶值为6.5。以1号瓶及3号瓶的值为参考，对2号瓶的香气进行评价。

1. 2号瓶中异硫氰酸酯；2. 3号瓶中异硫氰酸酯；3. 3号瓶中4-甲硫基戊腈；4. 2号瓶中4-甲硫基戊腈。图4 文兴西兰花种子催化脱水甘蓝菜实验SPME- GC- MS分析结果Fig.4 Results of SPME- GC- MS detection on catalytic dehydrated cabbage by Wenxing broccoli seeds

除了对脱水甘蓝菜进行了实验分析之外，对其他的脱水蔬菜、新鲜蔬菜及熟制蔬菜也进行了同样的实验分析，测定结果见表2。由表2可知，脱水的十字花科蔬菜复水之后，再经过文兴西兰花种子的催化，其特征性的气味恢复很大，评香员一致认为浓度过高，产生了 “菜臭味”。炒白菜、炒西葫芦是家常菜品，在家常菜品的基础上仍旧能够恢复原有菜品的菜香。表2中的普通蔬菜不仅包括十字花科的蔬菜，还包括部分菊科、藜科、百合科蔬菜。西兰花种子也能够恢复这些蔬菜原有的味道。

表2 文兴西兰花种子催化不同蔬菜的感官评价 结果及检测结果Tab.2 Results of sensory evaluation and GC/MS detection on different vegetables catalyzed by Wenxing broccoli seeds

3 结 论

西兰花种子作为天然植物的种子，拥有催化硫苷形成异硫氰酸酯等众多风味的天然酶。本研究探讨了不同品种西兰花种子的黑芥子酶比活力，并通过一系列实验测出了黑芥子酶催化硫苷形成异硫氰酸酯的最适温度范围为50～65 ℃，pH值为5～8。优选出在弱酸、中性与弱碱环境中均能体现出良好催化作用的文兴西兰花种子，并在50 ℃ 水中，采用该种子粉碎筛分之后的种子粉末对10种蔬菜进行香气恢复实验。结果表明：该种子粉末不仅能刺激新鲜蔬菜散发更多的特征性气味，还能在很大程度上恢复脱水蔬菜(如脱水甘蓝菜、脱水白菜、脱水菜心)及熟制蔬菜(如炒白菜、炒西葫芦)的天然香味。除十字花科蔬菜之外，又尝试了对其他科蔬菜的催化实验。经过实验验证，文兴西兰花种子粉末不但能刺激十字花科的蔬菜产生菜香，还能刺激其他科的部分蔬菜产生天然菜香。本研究表明，通过加入外源的天然黑芥子酶使菜品恢复原有的风味，可以解决部分蔬菜的风味损失问题，开拓了黑芥子酶在新领域的应用研究，为黑芥子酶在食品方面的应用提供了一个新的参考方法。