HPCE法测定塞北紫堇中的原阿片碱含量
2019-11-04卢永昌
李 欣,卢永昌
(1.青海民族大学药学院,青海西宁810007;2.青海省药物分析重点实验室,青海西宁810007;3.青海省青藏高原植物资源化学研究重点实验室,青海西宁810007)
塞北紫堇(Corydalis impatiens)为罂粟科紫堇属,主要分布于青海、甘肃、内蒙古等地,生山地疏林中或草坡上。在藏药中,主要用于治疗高血压、肝炎、肠胃炎及活血化瘀等[1-2]。生物碱是存在于塞北紫堇中的一大主要成分,具有抗炎、镇痛等药理活性[3-4]。通过建立高效毛细管电泳法来测定其生物碱含量的技术研究较少,现采用HPCE法测定其原阿片碱的含量,为其进一步的开发利用提供一定的依据。
1 实验材料与仪器
1.1 实验仪器
美国Agilent7100毛细管电泳系统、石英毛细管(64.5 cm×50 μm,有效长度56 cm),pHS-3C 酸度计(成都世纪方舟科技有限公司),AL204电子天平(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司上海分公司),KQ3200超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司),优普超纯水制造系统(四川优普超纯科技有限公司)。
1.2 实验试剂及实验药材
硼砂、盐酸(药集团化学试剂有限公司);甲醇,乙腈;原阿片碱对照品(批号:MUST-18110711)。
药材于2018年采于青海省,由青海民族大学林鹏程教授鉴定,确定为塞北紫堇。
2 实验方法
2.1 溶液制备
供试样品溶液的制备:称取塞北紫堇粉末约0.5 g,加甲醇10 mL,超声提取。
对照品溶液:称取原阿片碱对照品0.28 mg,用甲醇溶解并定容。
所制备的溶液均用0.45 μm 微孔滤膜过滤。
2.2 电泳条件
检测波长270 nm;压力进样5 mba×5 s;分离电压17 kV;毛细管温度20 ℃;选用50 mmol/L 硼砂-15%的乙腈为缓冲溶液(pH = 8.85),并过0.45 μm 微孔滤膜过滤。
供试品A、对照品B溶液的HPCE图谱见图1。
2.3 线性关系考察
分别移取原阿片碱对照品溶液0.3、0.8、1.3、1.8、2.3、2.8 mL,置于 10 mL 量瓶中 ,用甲醇定容至刻度,电泳测得各个对照品浓度所对应的峰面积,并以峰面积为纵坐标,以对照品浓度为横坐标做标准曲线。得回归方程为Y= 2369.1X+20.623。结果表明原阿片碱在浓度为0.006 ~0.056 mg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。
2.4 精密度试验
取对照品溶液,连续进样6 次,记录原阿片碱的峰面积并计算RSD为1.25%。表明用此方法的精密度良好。
2.5 稳定性试验
取供试品溶液,分别于 0、2、4、6、8 h 进样, 计算RSD为1.76%。实验结果表明该供试品溶液在8 h内是稳定的。
图1 供试品A、对照品B溶液的HPCE图谱
2.6 重复性试验
称取塞北紫堇药材6 份,用甲醇超声提取,测得原阿片碱相应峰面积并计算其RSD为1.97%。实验结果表明该试验的重复性较好。
2.7 加样回收率
称取已知原阿片碱含量的细果角茴香样品6份,分别按80%、100%、120%3个浓度加入原阿片碱对照品,制备供试品溶液,电泳测得原阿片碱的加样回收率及RSD为0.4%。
3 讨论
3.1 缓冲液的选择
通过几种缓冲液的选择:磷酸-甲醇、磷酸-乙腈、硼砂-甲醇、硼砂-乙腈,发现硼砂-乙腈的的分离效果最佳。
3.2 缓冲溶液pH的选择
确定硼砂-乙腈缓冲体系后,用不同的酸、碱调缓冲液的pH, 最后确定为用HCl 调至pH = 8.73为最佳,分离效果达到做好。
3.3 有机溶剂的选择
甲醇、乙腈能够增加毛细管的电渗流,从而改善分离效果。乙腈和甲醇的图谱进行对比,乙腈的分离效果优于甲醇。
3.4 分离电压
分离电压的大小决定出峰的快慢,当达到17 kV时出峰最为恰当。
通过多种因素的考察,包括缓冲溶液、pH、分离电压、有机溶剂等,发现在5 min内,分离电压为17 kV、以四硼酸钠-乙腈为缓冲溶液且pH 为8.85时,分离效果最为满意,原阿品碱完全分离。添加少量的乙腈可以改善分离效果,乙腈的体积不宜过高,否则会导致毛细管内残留结晶。