氨基硅胶固定脂肪酶的制备及其酶学性质研究

徐 然，韩生华，王利刚，李春成，刘之博

(1.山西大同大学化学与环境工程学院，山西大同037009;2.南京信息工程大学，江苏南京210044)

脂肪酶(Lipase)是一类羧基酯水解酶，可催化酯类物质的解酯、酯交换以及酯合成等反应[1]。与普通化学催化剂相比，脂肪酶具有高催化活性、高特异性以及绿色环保性等优点[2]，已逐步应用于日化、能源、医药以及食品等领域[3-4]。然而，游离状态的脂肪酶稳定性差、成本高、无法回收利用，使得脂肪酶难以进一步被工业化应用[5]。脂肪酶固定化技术的出现及发展逐步解决了游离脂肪酶的这些缺点[6]。脂肪酶固定化技术是指通过某些化学或者物理的方法将脂肪酶限制在特定的空间范围内发生酶促反应的技术[7-8]。常用的脂肪酶固定化技术包括吸附法、交联法、包埋法以及共价结合法[9-10]，其中，共价结合法制备的固定化脂肪酶具有稳定性高、不易失活等优点更受到广泛研究。

我们采用共价结合法制备固定化脂肪酶，并对固定条件进行了优化，对固定后脂肪酶的酶学性质进行了研究，以期为其今后工业化应用提供参考。

1 实验部分

1.1 实验仪器与试剂

DF-101S集热式恒温磁力搅拌器、HH-S2两孔水浴锅、SHZ-D循环水式真空泵，购自巩义市予华仪器有限责任公司；MA200电子天平，购自上海良平仪器仪表有限公司；101AB-1 电热鼓风干燥箱，购自菏泽市石油化工学校仪器设备厂；KDM 电热套，购自山东省鄄城大华仪器厂；SB—5200DTDN超声波清洗机，购自宁波新芝生物科技股份有限公司。

脂肪酶，实验室自制（酶活力：6.08×104μmol/g)；戊二醛50%，天津市河东区红岩试剂厂；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氢氧化钠、邻苯二甲酸氢钾、无水乙醇、聚乙烯醇均为分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司；橄榄油，成都科龙化工试剂厂。

1.2 实验方法

1.2.1 醛基硅胶的制备

取实验室自制氨基硅胶（氨基键含量为1.019 1 mmol/g）于锥形瓶中，加入适量一定浓度的戊二醛溶液，在室温下搅拌反应。将反应之后的溶液抽真空过滤，用去离子水将多余的戊二醛冲洗干净，于室温下干燥后对固体进行收集。

1.2.2 脂肪酶的固定化

取0.5 g 上述醛基硅胶，加入5 mL 1 mg/mL 的脂肪酶液和5 mL pH为7.5的0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液，在室温下磁力搅拌6 h。将反应后的溶液进行抽真空过滤，分别对滤液及固定酶进行收集，固定酶于室温下干燥备用。

分别对加入反应的游离酶、反应后的滤液以及固定酶进行酶活的测定，以下列公式进行酶活回收率的计算：

1.2.3 脂肪酶活力测定

采用橄榄油乳化法对酶活进行测定。

将5.0 mL 乳化剂和4.0 mL 0.1 mol/L pH 为8.0的磷酸缓冲液分别加入到空白a、样品b和样品c锥形瓶中，于40 ℃恒温水浴锅里保温5.0 min，样品b、c 加入1.0 mL 待测酶液反应10.0 min 后，分别向3 个瓶子中加入20.0 mL 无水乙醇同时终止反应。加入酚酞作指示剂，用NaOH 溶液滴定反应出来的脂肪酸，当溶液变微红时记录滴定过程所用NaOH的体积量。

式中：a—空白 a 消耗的 NaOH 溶液的体积，b、c—样品b、c消耗的NaOH 溶液的体积，N—NaOH的浓度，F—稀释倍数，T—反应所需时间（min）

2 结果与讨论

2.1 脂肪酶固定化条件的优化

2.1.1 戊二醛浓度对酶固定化的影响

分别采用0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的戊二醛进行优化，戊二醛浓度对酶固定化的影响见图1。随着戊二醛浓度的增大，酶活回收率呈先上升后下降趋势，在戊二醛浓度为1.5%时，酶活回收率最大。这是因为在戊二醛浓度较低时，可与酶结合的醛基数量较少。当戊二醛浓度提高时，有更多的醛基与氨基硅胶中氨基发生结合，相应的固定化酶的数量也有所提高，故酶的固定率提高。但戊二醛浓度过大时，与醛基发生键合的酶量增加，这使得酶催化反应的空间位阻也增加，从而导致酶活回收率下降。

图1 戊二醛浓度对酶活回收率的影响

2.1.2 给酶量对酶固定化的影响

分别采用0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/ mL 的脂肪酶溶液进行优化，给酶量对酶固定化的影响结果如图2。在酶的浓度低于0.5 mg/mL 时，其酶活回收率随浓度的提高而提高。在酶浓度为0.5 mg/ mL时，酶活回收率最大。继续增大酶浓度，其酶活回收率反而降低。

图2 酶液浓度对酶活回收率的影响

当脂肪酶浓度较低时，脂肪酶可以充分与醛基硅胶结合，固定化脂肪酶的酶活回收率取决于加入的脂肪酶的浓度，当脂肪酶浓度升高时，相应的固定酶的酶活回收率也增加。当脂肪酶浓度持续增大时，脂肪酶分子间会竞争结合醛基硅胶增加空间位阻，反而造成酶活回收率降低。

2.1.3 pH对酶固定化的影响

分别采用pH 为5.5、6.5、7.5、8.5、9.0 进行优化，酸碱度对酶固定化的影响如图3。在pH 低于7.5时，酶活回收率随pH 的升高而提高；在pH 为7.5时，酶活回收率最大。此后继续增大pH，酶活回收率呈下降趋势。

pH 的大小会影响脂肪酶的带电荷量、空间构象以及酶活性基团的解离状态。pH 会改变酶的微观结构，从而改变酶的催化能力。过酸或过碱的环境都会引起酶的空间结构发生变化而失去活力。

图3 pH对酶活回收率的影响

2.1.4 固定时间对酶固定化的影响

分别采用3、6、12、15、18 h 固定时间进行优化。固定时间对酶固定化的影响如图4。在固定时间少于6 h 时，酶活回收率随着固定时间的增加而显著提高；在固定时间为6 h 时，酶活回收率达到最大。继续增加反应时长，所测得的酶活回收率略微下降。

图4 固定时间对酶活回收率的影响

图中出现这样的趋势是因为酶活性高低不仅仅取决于其与醛基键合的时间，同时也受到戊二醛变性作用的影响。随着反应时间的延长，二者之间的键合反应进行的越完全，酶的固定量也高，但过度的键合反应会引起蛋白质的变性，同时固定后的酶也会随时间而出现一定程度的失活。

2.1.5 温度对酶固定化的影响

分别采用0、20、30、40、50 ℃ 进行优化。温度对脂肪酶固定化的影响如图5。酶活回收率随着温度的升高呈先增加后下降的趋势，在固定温度为30 ℃时，酶活回收率最大为49.6%。

图5 温度对酶活回收率的影响

温度对脂肪酶的影响很大，在一定范围内，升温能使酶的固定速度增加。但温度过高会导致酶蛋白的化学结构发生变形，从而使酶蛋白变性，所以超出一定的温度范围会使脂肪酶失活而影响酶活回收率。

2.2 游离脂肪酶和固定化脂肪酶酶学性质的比较

2.2.1 最适反应温度的比较

将游离脂肪酶和固定化脂肪酶分别放入10、20、30、35、40 及50 ℃ 的催化温度下测定酶活，结果如图6。游离酶经固定化后其酶学性质中的最适反应温度由40 ℃降低到35 ℃，这是因为酶的刚性结构发生了变化。但随着温度的升高，两种脂肪酶的酶活都会大幅度下降，是因为过高的温度会导致酶蛋白的空间结构发生改变而失活。

图6 游离脂肪酶和固定化脂肪酶的反应温度曲线

2.2.2 最适反应pH的比较

将游离脂肪酶和固定化脂肪酶在其各自最适温度下分别放入pH 为5.5、6.5、7.5、8.0、8.5、9.0 的催化环境中测定酶活。结果如图7，游离酶和固定酶的最适反应pH均为8。在其他条件相同的情况下，pH不仅可以影响酶的活性，同样会影响反应底物的解离状态。过高或过低的pH都不利于酶的催化。

图7 游离脂肪酶和固定化脂肪酶的反应pH曲线

2.2.3 热稳定性分析

将游离脂肪酶和固定化脂肪酶分别放置在30、40、50、60、70 ℃的环境中1 h后再测定其脂肪酶活力，以各自酶活损失百分比（损失酶活占初始酶活的百分数）为纵坐标，温度为横坐标作图8。

图8 脂肪酶的酶活损失百分比图

在不同的温度下放置1 h 后，可以看出，在任何温度下，游离脂肪酶比固定化脂肪酶的酶活损失都要高。酶分子的伸展变形以及分子的自我变形可能是酶失活的主要原因，而固定化酶中载体的存在增加了酶分子的刚性阻止了它的变形。但随着温度逐渐升高，酶活损失量不断增加，这是因为增加的刚性是有一定限度的。

2.2.4 有机溶剂稳定性分析

将游离酶和固定酶分别放置于10 mL 的甲醇、丙酮、石油醚、环己烷溶液中1 h 后测定其脂肪酶活力。酶在有机相中的稳定性是影响其能否长时间且有效进行催化反应的重要因素。以酶活损失百分比为纵坐标，各种有机溶剂为横坐标作图9。可以看出在非极性有机溶剂环己烷中两种酶酶活损失较少，而在极性溶剂如丙酮、甲醇中酶活损失较多。但总体上固定酶在有机溶剂中损失酶活量较少，比游离酶在有机相中更稳定。

2 种酶在有机溶剂中的酶活都降低了，且酶在非极性有机溶剂的耐受性要高于在极性有机溶剂，如在环己烷中的酶活始终高于在甲醇中的酶活，这可能是由于非极性溶剂不易夺取酶构象中的必需水，而极性溶剂恰恰相反，从而导致酶活性中心结构发生变化而使酶失去活性。所以，脂肪酶在有非极性有机溶剂中难失活的性能有助于推动有机相催化反应的发展。

2.2.5 重复使用性分析

对游离脂肪酶和固定化脂肪酶分别进行重复使用性分析，结果如图10。游离脂肪酶无法进行回收再利用，没有重复利用性。固定化脂肪酶经过6次重复使用之后，仍有38.24 %的初始固定酶活。重复使用性是固定化脂肪酶的一大特点，将有助于降低使用成本、实现工业化应用。

图10 固定化酶的重复利用性曲线

2.2.6 储存稳定性

将游离脂肪酶和固定化脂肪酶分别放置于室温环境下，并在每天固定时间点测定酶活力。酶的活性会随着储存时间的延长而逐渐下降，拥有好的稳定性会使其更适合在工业等方面的应用。以相对酶活率为纵坐标，时间为横坐标作图11。可以看出，固定化脂肪酶的稳定性比游离脂肪酶更好，在放置5 d后仍有34.12%的初始固定酶活。

图11 酶的储存稳定性曲线

3 结论

采用共价结合法将游离脂肪酶固定于自制氨基硅胶上，通过优化固定条件可使其酶活回收率达到49.6%。并进一步对比了游离脂肪酶与固定化脂肪酶的酶学性质，表明脂肪酶经固定后，不仅获得了重复使用性，且其热稳定性、有机溶剂稳定性及储存稳定性都得到增强。固定化脂肪酶将极大降低游离脂肪酶的使用成本，为其今后工业化应用提供参考。