TSK-GEL色谱柱测定注射用氟氯西林钠聚合物的研究

李 伟，曹晓云

(天津市药品检验研究院，天津 300070)

氟氯西林钠为半合成青霉素类抗生素，主要用于耐青霉素金黄色葡萄球菌的严重感染及败血症[1]，注射用氟氯西林钠为其原料直接无菌分装制剂。《中国药典》自2015年版开始收载原料及其制剂，但并未对聚合物检查项进行控制[2]。本试验采用TSK-GEL色谱柱对注射用氟氯西林钠中聚合物进行控制，和葡聚糖凝胶(G-10)色谱柱检测聚合物的方法相比具有灵敏度高、检验时间短等优势，提高了检验效率，完善了该品种的质量标准，为进一步提高药品质量奠定了良好基础[3]。

1 仪器与试药

1.1仪器 Agilengt 1200 系列高效液相色谱系统(美国Agilent 公司)，METTLER TOLEDO XS 205型电子分析天平(瑞士梅特勒公司)，TSK-GEL G2000SWXL(300 mm×7.8 mm，5 μm)色谱柱(日本TOSOH株式会社)。

1.2试药 氟氯西林对照品(中国药品生物制品检定所，批号130529-200301，纯度92.6%)；注射用氟氯西林钠(山西振东泰盛制药有限公司，规格0.25 g，批号1209121、1209131、1209141、1508201、1508202、1508203)；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氢氧化钠均为分析纯(天津市赢达稀贵化学试剂厂)，盐酸为优级纯(天津市化学试剂五厂)，30%过氧化氢为分析纯(天津市北方天医化学试剂厂)，乙腈为色谱纯(Merck公司)。

2 方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱：TSK-GEL G2000SWXL (300 mm×7.8 mm，5μm)。 流动相：磷酸盐缓冲液(pH 7.0)[0.04 mol/L磷酸氢二钠溶液-0.04 mol/L磷酸二氢钠溶液(61∶39)]-乙腈(95∶5)，流速为0.8 ml/min，检测波长为215 nm，进样量为20 μl。

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液制备 取氟氯西林对照品10.58 mg，置50 ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，作为对照品储备液。精密量取对照品储备液5 ml置100 ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，作为对照品溶液。

2.2.2供试品溶液制备 取供试品适量，精密称定，加流动相溶解并定量稀释制成每1 ml中含氟氯西林1 mg的溶液，作为供试品溶液(临用新制)。

2.2.3系统适用性溶液制备 取供试品溶液置沸水浴中加热3 min，放至室温，作为系统适用性溶液。

2.2.4灵敏度测试溶液制备 精密量取对照品溶液2 ml置100 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，作为灵敏度测试溶液。

2.3系统适用性试验及灵敏度测试 取“2.2.3”项下系统适用性溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，氟氯西林峰与相对保留时间约为0.84的最大热降解产物(取供试品溶液10 ml，置水浴加热3 min，放置至室温)峰之间的分离度为5.96。取“2.2.4”项下灵敏度测试溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，主成分峰高的信噪比为16.4。系统适用性试验及灵敏度测试试验可有效控制色谱系统。见图1。

1、3、4.聚合物 2.最大热降解产物 5.氟氯西林

2.4专属性试验

2.4.1酸破坏 取供试品溶液10 ml，加0.1 mol/L的盐酸溶液1 ml，水浴加热1 min后，放置至室温，加0.1 mol/L的氢氧化钠溶液1 ml，摇匀，按“2.1”项下色谱条件测定。

2.4.2碱破坏 取供试品溶液10 ml，加0.1 mol/L的氢氧化钠溶液1 ml，水浴加热1 min后，放置至室温，加0.1 mol/L盐酸溶液1 ml，摇匀，按“2.1”项下色谱条件测定。

2.4.3氧化破坏 取供试品溶液10 ml，加1%的过氧化氢溶液1 ml，室温放置4 min后，按“2.1”项下色谱条件测定。

2.4.4光照破坏 取供试品溶液10 ml，置254 nm紫外灯下光照30 min后，按“2.1”项下色谱条件测定。

2.4.5加热破坏 取供试品溶液10 ml，置水浴加热3 min后，放置至室温，按“2.1”项下色谱条件测定。

专属性试验表明，注射用氟氯西林钠在酸、碱、氧化、光照、加热条件下均不稳定，主峰前杂质个数和杂质峰面积均明显增加，专属性好，结果见表1和图2。

表1 专属性试验结果

1.氟氯西林 2～8.破坏产生的杂质

2.5线性关系与范围 分别精密量取“2.2.1”项下对照品储备液0.05、0.25、0.5、1.0、2.5、5、10和25 ml，置50 ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，按“2.1”项下色谱条件测定。溶液浓度与聚合物峰面积的线性回归方程为Y=71.091X-6.156 2(r=1.000 0)。结果表明：对照品溶液在0.195 9～97.970 8 μg/ml浓度范围内，溶液浓度与聚合物峰的峰面积之间线性关系良好。

2.6精密度试验 取“2.2.1”项下的氟氯西林对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件重复测定6次，峰面积的RSD为0.12%(n=6)，该方法精密度良好。

2.7重复性试验 取1508201批样品按“2.2.2”项下方法制备6份供试品溶液(临用新制)，按“2.1”项下色谱条件测定，6份样品的聚合物含量分别为0.77%、0.76%、0.78%、0.79%、0.77%和0.78%，RSD为1.35%(n=6)，表明重复性良好。

2.8供试品取样量与聚合物测定结果的相关性考查 取1209121批样品约12.5、25和50 mg，分别置3个25 ml量瓶中，按“2.2.2”项下方法制备成供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，结果表明，供试品取样量在12.63～50.46 mg范围内，供试品取样量与聚合物峰的峰面积之间线性关系良好，二者之间有明确的相关性。供试品取样量与聚合物峰的峰面积的线性回归方程为Y=25.323X+3.306 9(r=1.000 0)。

2.9最低检测限 取对照品溶液1 ml置200 ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，按“2.1”项下色谱条件试验，最低检测浓度为0.049 μg/ml，其峰高为噪音的4.4倍，计算最低检测限为0.004 9%。

2.10供试品溶液的稳定性 取1508201批样品制成供试品溶液，分别于4 ℃条件下放置1、2、3、4、5、6、7和8 h后，按“2.1”项下色谱条件测定，计算保留时间小于氟氯西林峰的各杂质峰面积的和，结果表明，杂质总和随放置时间的延长略有增加。见表2。因此，供试品溶液配制好后应于低温保存并尽快进样分析。

表2 稳定性试验结果

2.11样品的测定 取6批注射用氟氯西林钠样品(批号1209121、1209131、1209141、1508201、1508202、1508203)，按“2.2.2”项下方法配制成供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，色谱图见图3，检验结果见表3。

1.氟氯西林 2～4.聚合物

表3 6批供试品聚合物检验结果

3 讨论

3.1流动相的选择 取对照品溶液和供试品溶液，分别选用以下5种流动相进行测定：A、磷酸盐缓冲液(pH 7.0) [0.01 mol/L磷酸氢二钠-0.01 mol/L磷酸二氢钠(61∶39)]-乙腈(95∶5)；B、磷酸盐缓冲液(pH 7.0)[0.01 mol/L磷酸氢二钠-0.01 mol/L磷酸二氢钠(61∶39)]-乙腈(98∶2)；C、磷酸盐缓冲液(pH 7.0) [0.01 mol/L磷酸氢二钠-0.01 mol/L磷酸二氢钠(61∶39)]；D、磷酸盐缓冲液(pH 7.0) [0.02 mol/L磷酸氢二钠-0.02 mol/L磷酸二氢钠(61∶39)]-乙腈(95∶5)；E、磷酸盐缓冲液(pH 7.0)[0.04 mol/L磷酸氢二钠-0.04 mol/L磷酸二氢钠(61∶39)] -乙腈(95∶5)。 以A为流动相时，主峰前的杂质峰不能完全分离；以B、C、D为流动相时，杂质虽然分离较好，但是对照品溶液色谱图中主峰分叉；以E为流动相时，杂质分离效果好，对照品溶液色谱图中主峰峰形也较好。故选用pH 7.0的磷酸盐缓冲液[0.04 mol/L磷酸氢二钠-0.04 mol/L磷酸二氢钠(61∶39)]-乙腈(95∶5)作为流动相。

3.2测定波长的选择 以磷酸盐缓冲液(pH 7.0)[0.04 mol/L磷酸氢二钠-0.04 mol/L磷酸二氢钠(61∶39)]-乙腈(95∶5)作为流动相，用DAD检测器对供试品溶液进行全波长扫描，在215 nm波长处有最大吸收，故确定以215 nm为检测波长。

3.3溶剂的选择 以磷酸盐缓冲液(pH 7.0)[0.04 mol/L磷酸氢二钠溶液-0.04 mol/L磷酸二氢钠溶液(61∶39)]-乙腈(95∶5)为流动相，检测波长为215 nm，分别取水和流动相依法检测。以水作溶剂时，在13.799 min处有倒峰，干扰检测；而用流动相作溶剂时，对检测没有干扰，故确定以流动相为溶剂。

《中国药典》2015年版二部收载的青霉素类抗生素如阿莫西林、青霉素V钾、青霉素钠、苯唑西林钠、氯唑西林钠等品种都采用葡聚糖凝胶(G-10)色谱柱对高聚物进行测定[4]，该方法分析时间较长(约50 min)，而且检测到的聚合物以混合物的形式存在，灵敏度不高。而本试验建立的方法首先将检验时间缩短至20 min以内，其次将聚合物有效分离，大大提高了检验效率和灵敏度。专属性试验表明，本品在氧化、光照和加热条件下不稳定，考虑本品为无菌分装制剂，在玻璃瓶和胶塞的密封条件下，不易接触氧化剂；而在运输和贮存过程中，光照和高温条件容易产生，所以提示生产、运输和销售环节，本品应避光和避免高温。