大黄和五倍子有效成分配伍的液体抑菌制剂的制备与抑菌能力表征

李晓凡，曹 申，马 坤，宁 佳，郝伟亮，宋丹妮，徐 亮，张彦文*

(1.天津医科大学药学院，天津 300070； 2.天津市口腔医院，天津 300041； 3.天津医科大学口腔医院，天津 300070； 4.天津市南开医院,天津 300100； 5.天津医学高等专科学校，天津 300222)

大黄是廖科植物大黄的干燥根及根茎，味苦而涩，具有泻热通肠，凉血解毒的功效。现已确定，大黄的主要成分为蒽醌类化合物，主要包括：大黄酸、大黄素、大黄素甲醚、芦荟大黄素和大黄酚。目前认为，蒽醌类化合物有很好的杀菌作用，但是由于5种成分在大黄中的含量不一，其中大黄素和芦荟大黄素含量最多，并且提取物的味道更温和，因此选择提取大黄素和芦荟大黄素作为大黄中有效成分代表。

五倍子又称文蛤、百虫仓，是一种常用中药，含有鞣质、没食子酸等，主要成分为没食子酸。没食子酸是一种多酚类化合物，具有抑菌、抗突变、抗肿瘤的作用[1]，有低毒[2]，中国产五倍子中含有大量可水解的五倍子单宁，没食子酸可通过水解五倍子单宁获得[3]。

国内对大黄的抑菌作用做了一些研究，梁勤等[4]用肉汤稀释法研究了甘肃道地药材大黄对产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)大肠埃希菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的最小抑菌浓度；侯媛媛等[5]利用UPLC-MS-MS研究了大黄对食源性致病菌大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果；宋丽琴[6]用滤纸片法研究了不同炮制条件下的大黄对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、链球菌等6种菌的抑制作用；李成林等[7]直接研究了大黄中有效成分大黄素和芦荟大黄素对金黄色葡萄球菌的抑制作用。这表明，大黄中抑菌成分较多，大黄中的单一成分可以作为研究的重点。

现已表明五倍子的主要成分为没食子酸，学者对五倍子抑菌作用的研究主要集中在没食子酸的抑菌作用上。张雅丽[1]、卢晓[8]、王广娟[9]单独研究了没食子酸对常见菌金黄色葡萄球菌等的抑制作用；除此之外，刘玉梅等[10]以及席清平等[11]研究了没食子酸对几种口腔常见菌变异链球菌、血链球菌、变形链球菌、粘性放线菌、牙龈卟啉单胞菌的抑制作用。表明没食子酸抗菌效果好，应用范围广，可以应用于不同用途。

查阅现有资料，有关大黄和五倍子组合使用的文献较少，蒋玲玲等[12-14]使用煎煮法将大黄和五倍子配伍使用，但是煎煮法存在很多问题：①产品因处于水环境下易腐败变质；②产品质量受道地药材的限制；③有效抑菌成分不明确，产品质量均一性差。为此，本试验提取了大黄中的有效成分，并根据有效成分的含量和气味、色泽等物理性质选择了大黄素和芦荟大黄素与五倍子的主要成分没食子酸进行配伍，制成了一种抑菌水溶液，并且从文献中选择了具有代表性的几种菌：金黄色葡萄球菌、变形链球菌、血链球菌、粘性放线菌、牙龈卟啉单胞菌、表兄链球菌[15]、内氏放线菌作为此制剂的测试菌种，经试验，该制剂成分明确，抑菌作用较好，可应用范围广泛。

1 仪器与试剂

1.1仪器 SIL-20A高效液相色谱仪(日本岛津)；XP205电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；比浊仪(美国BBLTM CrystalSpecTM Nephelometer公司)。

1.2试剂 甲醇(分析纯，天津光复精细化工研究所)；盐酸(分析纯，天津光复精细化工研究所)；三氯甲烷(分析纯，天津光复精细化工研究所)；冰醋酸(分析纯，天津光复精细化工研究所)；硫酸(分析纯，天津光复精细化工研究所)；石油醚(分析纯，天津光复精细化工研究所)；山梨酸钾(宁波王龙科技股份有限公司)；超纯水(Milli-Q A10超纯水机自制)；羧甲基纤维素钠(上海申光食用化学品有限公司)；薄荷味食用香精(宁波威龙香精香料有限公司)；食用甘油(瑞鑫糖艺工具厂)；食用维生素C(郑州指南针生物科技有限公司)；大黄(购于北京同仁堂天津南开大药房，批号20180606，经天津医科大学药学院唐铖教授鉴定)；芦荟大黄素对照品(西安开来生物工程有限公司，纯度为98%，批号20180825)；大黄素对照品(西安开来生物工程有限公司，纯度为98%，批号20180813)； 没食子酸对照品(西安开来生物工程有限公司，纯度为98%，批号20180719)。

1.3菌种信息 内氏放线菌 (Actinomycesnaeslundii，菌落编号BNCC106505)购自北纳生物，-80 ℃冻存，37 ℃、CM0006培养基上培养；血链球菌(Streptococcussanguinis，菌落编号BNCC134927)购自北纳生物，2～8 ℃冷藏保存，37 ℃、5% CO2条件下，在哥伦比亚血平板上培养；牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis，菌落编号BNCC 337441)购自北纳生物，2～8 ℃冷藏保存，37 ℃、严格厌氧条件下，在即用型哥伦比亚血平板上培养；粘性放线菌(Actinomycesviscosus，菌落编号BNCC336944)购自北纳生物，2～8 ℃冷藏保存，37 ℃、5% CO2条件下，在即用型哥伦比亚血平板上培养；金黄色葡萄球菌(Actinomycesviscosus，菌落编号BNCC186335)购自北纳生物，2～8 ℃冷藏保存，37 ℃条件下，在营养琼脂/肉汁培养基上培养；变形链球菌(Streptococcusmutans，菌落编号ATCC700610)购自ATCC，-20 ℃保存，37 ℃、5% CO2条件下，在脑心注射琼脂/肉汤培养基上培养；表兄链球菌(Streptococcussobrinus，菌落编号ATCC700610)购自ATCC，-20 ℃保存，37 ℃、5% CO2条件下，在脑心注射琼脂/肉汤培养基上培养。

2 试验方法

2.1大黄素及芦荟大黄素的提取 取大黄粉50 g，置于500 ml圆底烧瓶中，加20%H2SO4溶液100 ml，氯仿50 ml，水浴回流2 h，倾出上清液，烧瓶残渣加20%H2SO4溶液50 ml、氯仿100 ml，水浴继续回流1 h，合并提取液，分离氯仿层，水洗两次。将氯仿提取液置于1 000 ml分液漏斗中，以2.5%NaHCO3水液200 ml分两次萃取，弃去水层合并氯仿层，以2.5% Na2CO3水液300 ml分两次萃取，合并Na2CO3萃取液，加HCl酸化至pH=3，析出沉淀后静置抽滤得大黄素，低温干燥，以10 ml冰醋酸重结晶；合并氯仿液，以0.5% NaOH水液300 ml分两次萃取，合并水层，用加HCl酸化至pH=3～4，析出沉淀后静置抽滤得芦荟大黄素，低温干燥，以10 ml冰醋酸重结晶。

2.2高效液相色谱条件 Kromasil C18柱，(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相：甲醇-水=(80∶20)，检测波长为254 nm[16]，流速为1.0 ml/min，柱温为25 ℃，进样量为20 μl。

2.3抑菌试验

2.3.13种有效成分的浓度选择 据文献记载，大黄素有效抑菌浓度为2～16 mg/100 ml，芦荟大黄素的有效抑菌浓度为1～8 mg/100 ml[7]，没食子酸的有效抑菌浓度为12.5～1 000 mg/100 ml[1,8-10]，因此本试验对3种提取物设计了不同浓度来考查对几种细菌的抑制作用。

2.3.2抑菌试验步骤 将各种菌株复苏48 h后，分别接种于脑心浸液琼脂(BHI)液体培养基中，在80%氮气、20%二氧化碳、37 ℃下厌氧培养24 h，涂片检查为纯培养后，应用比浊仪测定各菌悬液的浓度，用BHI培养基将所有菌悬液浓度调至3×108cfu/ml备用。用打孔器将中性滤纸打成直径为6 mm的圆片，于120 ℃干热30 min后，无菌保存备用。制备含药滤纸片时，将滤纸片置于无菌的空培养皿内，在超净工作台上，打开培养皿盖，将待测药液1 ml缓慢滴加到滤纸片上。随后，盖上培养皿盖，并置于4 ℃冰箱内浸泡过夜，然后经冷冻干燥器冻干，4 ℃密闭保存。将各菌种接种于5 ml BHI液中，95%氮气、5%二氧化碳、37 ℃厌氧培养18 h，应用麦氏比浊标准，调节其浓度为108cfu/ml，取50 μl接种于100 mm平皿中，涂匀，小心夹取含药滤纸片放在琼脂培养基表面，轻压纸片，使其与琼脂恰当接触。在95%氮气、5%二氧化碳、37 ℃下培养48 h后，用游标卡尺测各纸片的抑菌圈大小。

2.4液体抑菌制剂的制备 制剂中没食子酸使用购买的没食子酸标准物，大黄素和芦荟大黄素使用实验室提取物。量取纯化水100 ml，向其中缓慢加入羧甲基纤维素钠0.15 g，边加边搅拌，至羧甲基纤维素钠完全溶解， 然后将没食子酸800 mg溶解在上述溶液中，随后加入大黄素8 mg、芦荟大黄素8 mg搅拌至溶解。最后根据文献报道[17-20]加入下列佐剂：甘油2.5 g，山梨酸钾0.02 g，薄荷味食用香精1 ml，维生素C 3 g。

3 结果与讨论

3.1大黄素和芦荟大黄素提取试验结果 取大黄素对照品、大黄素提取物、芦荟大黄素对照品与芦荟大黄素提取物分别制备成溶液，按“2.2”项下色谱条件进样分析，结果大黄素和芦荟大黄素提取物与大黄素和芦荟大黄素标准品的出峰时间相同，故说明本项目的提取方法实现了药材中大黄素和芦荟大黄素的富集分离。见图1和图2。

3.2抑菌试验结果 为了验证大黄素、芦荟大黄素和没食子酸的抑菌效果，本文选择了7种常见菌(金黄色葡萄球菌、变形链球菌、血链球菌、粘性放线菌、牙龈卟啉单胞菌、表兄链球菌、内氏放线菌)作为测试菌种，根据文献设置了不同浓度梯度，试验结果如图3-6所示。

1.大黄素

1.芦荟大黄素

为了探究大黄素对7种菌的抑制作用，作者查阅文献后设计了4个浓度梯度的大黄素溶液，用滤纸片法测定了各抑菌圈的直径，得到不同菌种抑菌圈的平均值和标准偏差后绘制了图3的柱状图。由图3可以看出，在浓度为2～8 mg/100 ml范围内，随着大黄素浓度的增加，大黄素对各测试菌种的抑制作用基本呈现上升趋势，因此在本文所选的浓度梯度内，大黄素浓度为8 mg/100 ml时，大黄素对各测试菌种的抑制作用最大。

图3 不同浓度的大黄素对测试菌种的抑制作用

图4 不同浓度的芦荟大黄素对测试菌种的抑制作用

为了探究芦荟大黄素对7种菌的抑制作用，作者查阅文献后设计了4个浓度梯度的芦荟大黄素溶液，用滤纸片法测定了各抑菌圈的直径，得到不同菌种抑菌圈的平均值和标准偏差后绘制了图4的柱状图。由图4可以看出，随着芦荟大黄素浓度的增加，芦荟大黄素对7种菌的抑制作用基本都呈现上升的趋势，因此在本文所选的浓度梯度内，芦荟大黄素浓度为8 mg/100 ml对所有的测试菌种都有最大的抑制作用，各个菌种抑菌圈直径最大。

为了探究没食子酸对7种菌的抑制作用，经文献调研后，作者设计了8个浓度梯度的没食子酸溶液，用滤纸片法测定了各抑菌圈的直径，得到不同菌种抑菌圈的平均值和标准偏差后绘制了图5的柱状图。由图5可知，在浓度为12.5～400 mg/100 ml时，随着没食子酸浓度的增加，没食子酸对各测试菌种的抑制作用均增加，当没食子酸浓度增加到800 mg/100 ml时，没食子酸对各个菌种的抑制作用产生了差异。因此在本文所选的浓度梯度内，没食子酸浓度为800 mg/100 ml对所有的测试菌种都有最大的抑制作用，各个菌种抑菌圈直径最大。

综上可知，大黄素浓度为8 mg/100 ml、芦荟大黄素浓度为8 mg/100 ml、没食子酸浓度为800 mg/100 ml时，对7种菌的抑制作用最强，因此以3种有效成分的最大抑菌浓度配伍制成抑菌制剂，考查其对7种菌的抑制作用，试验结果如图6和表1所示。由图可知，3种化合物组合使用对测试菌种均有较强的抑菌作用，抑菌圈直径均大于各组分单独使用时的抑菌圈直径(参见表1)。经SPSS软件分析，组合后的抑菌效果与单独使用三者相比，抑菌作用有明显的提高。图6和表1的结果表明3种化合物组合使用显著增强了抑菌效果，进一步揭示3种化合物的抑菌机制可能不同，有关工作有待进一步研究。

图5 不同浓度的没食子酸对测试菌种的抑制作用

图6 抑菌制剂对测试菌种的抑制作用

表1 3种提取物最大抑菌浓度抑菌圈大小及三者组合后的抑菌圈大小

4 结论及展望

本试验从大黄中提取了大黄素和芦荟大黄素，并将两者分别与标准品对照后确认了提取物的成分。

查阅文献后分别对大黄素设计了4个浓度梯度，对芦荟大黄素设计了4个浓度梯度，对没食子酸设计了8个浓度梯度，考查了三者对7种常见菌的抑制作用，发现当大黄素浓度为大黄素浓度为8 mg/100 ml、芦荟大黄素浓度为8 mg/100 ml、没食子酸浓度为800 mg/100 ml时，对各菌种的抑制作用较强；对三者按最佳抑菌效果配伍制成制剂后继续考查其抑菌效果，发现抑菌作用比单独使用各提取物的抑菌效果增强。因此该配伍方式合理，对所选菌种有很好的抑制效果。

所选菌种中除常见菌如金黄色葡萄球菌、变形链球菌等还有部分口腔常见菌，如牙龈卟啉单胞菌、表兄链球菌。研究发现，3种提取物以及所制备的配伍制剂对口腔常见菌也有抑制作用，表明大黄和五倍子提取物可以用于口腔辅助治疗，进一步可以考虑将三者配伍组合制成抑菌水剂用于临床上的口腔辅助治疗。