HPLC法同时测定白芷香豆素提取物中7种成分在大鼠血浆内的含量

张方亮，魏 悦，孙燕燕，何 新

(天津市儿童医院，天津 300742； 天津中医药大学，天津 300193)

白芷为伞形科植物白芷Angelicadahurica(Fisch ex Hoffm) Benth et Hook f或杭白芷Angelicadahurica(Fisch ex Hoffm) Benth et Hook f varformosana(Boiss) Shan et Yuan的干燥根，性温，气芳香，味辛，微苦，具有散风除湿、通窍止痛作用，用于治疗感冒头痛、眉棱骨痛、鼻渊等[1]。现代药理学研究表明，白芷具有抗炎、解热、镇痛、抗病原微生物的作用[2]，能抑制银屑病，治疗白癜风[3]，具有抗副交感神经的作用，有解痉止痛效果[4]。《中国药典》2015年版中29味成方药物中有收载[5]。主要活性成分为香豆素类化合物，以欧前胡素(imperatorin)和异欧前胡素(isoimperatorin)的含量居高[6]，本试验建立HPLC法同时测定血浆中7种香豆素(花椒毒酚、8-甲氧基-5-羟基补骨脂素、水合氧化前胡素、佛手柑内酯、欧前胡素、蛇床夫内酯、异欧前胡素、氧化前胡素)的含量，为白芷香豆素类化合物在大鼠体内药代动力学研究提供参数依据。见图1。

图1 线型呋喃香豆素类化合物

1 材料

1.1仪器 Agilent 1260 高效液相色谱仪，包括 Agilent 4212 二元泵、Agilent G1367E 标准自动进样器、Agilent G1312B 二极管阵列检测器及 G1322A柱温箱(美国 Agilent 公司)；高速离心机(型号：ALLEGRA-64R，美国BECKMAN公司)；分析天平(型号：MERRLER TOLEDO AX205，瑞士Mettler Toledo公司)；微型旋涡混合仪(型号：WH-3，上海沪西分析仪器厂有限公司)；氮气吹干仪(型号：MTN-2800D，天津市奥特塞恩仪器有限公司)；微量移液器(eppendorf)。

1.2试药 白芷香豆素提取物(实验室自制，采用大孔树脂作为吸附剂，不同浓度乙醇作为洗脱剂，分离纯化白芷总香豆素组分，测定含量为52.9%)；花椒毒酚、8-甲氧基-5-羟基补骨脂素、水合氧化前胡素、蛇床夫内酯对照品(实验室自制，经MS、1H-NMR、13C-NMR检测纯度98%以上)；欧前胡素对照品(购自中国药品生物制品检定所，批号110826-201616)；异欧前胡素对照品(购自中国药品生物制品检定所，批号110827-201611)；佛手柑内酯对照品(购自中国药品生物制品检定所，批号110825-201703 )；伞形花内酯对照品(批号 AB423U，含量99%，购自天津一方科技有限公司)；羧甲基纤维素钠(分析纯，天津市生物化学制药厂)；肝素注射液(1.25万单位∶2 ml，天津市生物化学制药厂)；甲醇为色谱纯(天津美瑞泰克集团有限公司)，乙酸乙酯等其他试剂均为分析纯。

1.3动物 SPF级SD大鼠，雄性，质量(200±10) g，周龄6周，购于北京稚通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK-(京)2016-0006。饲养于天津国际生物医药联合研究院药物安全评价中心SPF级屏障区，饲养环境温度22～27 ℃，相对湿度40%～70%，通风次数为10～15次/h全新风，12 h/12 h昼夜规律，自由饮食、饮水。动物实验方案符合实验动物伦理的相关规定。

2 方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱：Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；检测器：二极管阵列检测器；流动相A为甲醇，B为纯水，梯度洗脱：0～30 min:35%→90% A，30.5 min:35% A，30.5～40 min：35% A；流速:1.0 ml/min；检测波长：310 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μl。

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液的制备 精密称取花椒毒酚、8-甲氧基-5-羟基补骨脂素、水合氧化前胡素、佛手柑内酯、欧前胡素、蛇床夫内酯、异欧前胡素7种对照品各5.0 mg，置5 ml量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成浓度约为1 mg/ml的对照品混合液，置冰箱(4 ℃)保存。精密称取伞形花内酯0.18 mg，用甲醇溶解并稀释制成每1 ml中含有185 μg的溶液，置冰箱(4 ℃)保存。

2.2.2供试品溶液制备 精密称定白芷总香豆素提取物溶于甲醇中，配成浓度为1 mg/ml混悬液，超声溶解，备用。

2.2.3血浆样品预处理 麻醉大鼠后腹主动脉取血5 ml置于润有肝素的离心管中，3 000 r/min离心10 min，取上层血浆低温保存。取100 μl空白血浆，加入10 μl甲醇，微型涡旋机涡旋1 min,用800 μl乙酸乙酯萃取，涡旋5 min，14 000 r/min、4 ℃离心5 min，取800 μl上清，N2吹干，100 μl甲醇复溶后，14 000 r/min、4 ℃离心5 min，取上清20 μl进样。

2.3专属性考查 取大鼠空白血浆样品，除不加内标溶液外，其余按“血浆样品预处理”项下操作，获得空白样品的色谱图(A)；将一定浓度的含7种香豆素的混合对照溶液及内标溶液加入空白血浆，同法操作，获得相应色谱图(B)；同法操作得白芷香豆素提取物色谱图(C)。结果表明该实验条件下，专属性良好。见图2。

A.伞形花内酯 1.花椒毒酚 2.8-甲氧基-5-羟基补骨脂素 3.水合氧化前胡素 4.佛手柑内酯 5.欧前胡素 6.蛇床夫内酯 7.异欧前胡素

2.4标准曲线制备及线性范围的确定 取大鼠空白血浆100 μl，加入内标溶液10 μl，加入系列混合标准品溶液，配制成相当于花椒毒酚、8-甲氧基-5-羟基补骨脂素、水合氧化前胡素、佛手柑内酯、欧前胡素、蛇床夫内酯、异欧前胡素浓度为20、10、4、2、0.8、0.4、0.16、0.08、0.032和0.016 μg/ml的10个样品。按“2.1”项下色谱条件进样，以待测物浓度为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归运算，求得的典型直线回归方程及线性范围。7种成分的标准曲线及线性范围见表1。

表1 白芷总香豆素提取物中7种成分线性范围

2.5精密度考查 取含有花椒毒酚、5-羟基-8-甲氧基补骨脂素、水合氧化前胡素、佛手柑内酯、欧前胡素、蛇床夫内酯、异欧前胡素7种对照品混合溶液10 μl，加入到100 μl大鼠空白血浆中，乙酸乙酯萃取，N2吹干，100 μl甲醇复溶，离心，取上清连续进样6次。按照“2.1”项下色谱条件测得峰面积。计算得到样品中花椒毒酚RSD%为0.33%、5-羟基-8-甲氧基补骨脂素RSD为0.42%、水合氧化前胡素RSD为0.36%、佛手柑内酯RSD为0.31%、欧前胡素RSD为0.22%、蛇床夫内酯RSD为0.48%、异欧前胡素RSD%为0.36%，表明仪器精密度良好。

2.6重复性考查 按“供试品溶液制备”项下方法，称取6份白芷总香豆素提取物溶于甲醇中，配成浓度为1 mg/ml溶液。取10 μl加入到100 μl大鼠空白血浆中，乙酸乙酯萃取，N2吹干，100 μl甲醇复溶，离心，取上清按照“2.1”项下色谱条件进样，测得峰面积。结果测得血浆中花椒毒酚平均浓度为1.914 μg/ml，RSD为0.45%；5-羟基-8-甲氧基补骨脂素平均浓度为2.076 μg/ml，RSD为0.38%；水合氧化前胡素平均浓度为2.241 μg/ml，RSD为0.42%；佛手柑内酯平均浓度为1.063 μg/ml，RSD为0.69%；欧前胡素平均浓度为6.572 μg/ml，RSD为0.71%；蛇床夫内酯平均浓度为7.144 μg/ml，RSD为0.48%；异欧前胡素平均浓度为3.884 μg/ml，RSD为0.29%，表明方法重复性良好。

2.7稳定性考查 取“2.6”项下供试品溶液冻融3次后，按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算剩余百分数，结果显示花椒毒酚RSD为0.51%；5-羟基-8-甲氧基补骨脂素RSD为0.48%；水合氧化前胡素RSD为0.54%；佛手柑内酯RSD为0.35%；欧前胡素RSD为0.26%；蛇床夫内酯RSD为0.46%；异欧前胡素RSD为0.69%，表明供试品-20 ℃放置24 h内稳定性良好。

2.8加样回收率考查 分别精密称取花椒毒酚、8-甲氧基-5-羟基补骨脂素、水合氧化前胡素、佛手柑内酯、欧前胡素、蛇床夫内酯、异欧前胡素对照品适量，加甲醇制成浓度分别为0.022 6 、0.022 6、0.022 6、0.011 2、0.062 4、0.071 2和0.042 2 mg/ml的混合对照品溶液。精密称定6份已知含量的白芷香豆素提取物供试品溶液及混合对照品溶液各10 μl加入到6份100 μl大鼠空白血浆中，混匀后乙酸乙酯萃取，N2吹干，100 μl甲醇复溶，离心，取上清按“2.1”项下色谱条件进样测定。结果花椒毒酚的平均加样回收率为 81.42%，RSD 为 0.310%；8-甲氧基-5-羟基补骨脂素的平均加样回收率为 82.98%，RSD 为 0.378%；水合氧化前胡素的平均加样回收率为 86.78%，RSD 为 0.449%；佛手柑内酯的平均加样回收率为 85.65%，RSD 为 0.519%；欧前胡素的平均加样回收率为 84.37%，RSD 为 0.589%；蛇床夫内酯的平均加样回收率为 81.74%，RSD 为 0.530%；异欧前胡素的平均加样回收率为 79.88%，RSD 为 0.529%，均符合生物制品提取回收率符合要求。见表2-8。

表2 花椒毒酚加样回收试验结果(n=6)

2.9样品测定 精密称取白芷香豆素提取物3 批样品(A、B、C)，用甲醇配制成1 mg/ml溶液，取10 μl加入到100 μl大鼠空白血浆中，乙酸乙酯萃取，N2吹干，100 μl甲醇复溶，离心，取上清按照“2.1”项下色谱条件测定，计算得到提取物中7种香豆素成分含量，结果见表9。

表3 8-甲氧基-5-羟基补骨脂素加样回收试验结果(n=6)

表4 水合氧化前胡素加样回收试验结果(n=6)

表5 佛手柑内酯加样回收试验结果(n=6)

表6 欧前胡素加样回收试验结果(n=6)

表7 蛇床夫内酯加样回收试验结果(n=6)

表8 异欧前胡素加样回收试验结果(n=6)

表9 白芷总香豆素提取物中7种化合物的含量 mg/g

3 讨论

3.1检测波长的选择 分别取适量7种香豆素对照品，用甲醇溶解制备成溶液，进行紫外全波长扫描，绘制紫外吸收光谱。其中波长在310 nm左右，7种化合物的吸收波长均较大，且此处内源性物质干扰少，故选择310 nm为检测波长。

3.2流动相的选择 HPLC对流动相的基本要求是:①不与固定相发生化学反应；②对试样有适宜的溶解度；③必须与检测器相适应；④纯度要高，黏度要小。本试验考查了不同比例甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙腈-水、甲醇-水-冰醋酸的流动相系统时的色谱图[7，8]。结果表明，在梯度洗脱的条件下，流动相为甲醇-水时，白芷中主要化学成分都得到较好分离，且检出峰数目最多，保留时间合适，峰形良好。

3.3内标物的选择 内标物的选择很重要，其选择的基本原则是：①内标物应是试样中不存在的纯物质；②加入的量应该接近于被测组分；③内标物色谱峰位于被测组分色谱峰附近，或几个被测组分色谱峰中间，并与这些组分完全分离。本试验曾采用黄芩苷[9]作为内标物，在试验中发现黄芩苷在选定色谱条件下与样品成分不能分离，无法用于含量测定。结合文献报道，选用伞形花内酯[10]作为内标物。试验结果表明，在上述色谱条件下，伞形花内酯能与血浆中的杂质及7种测定的香豆素成分完全分离，不干扰被测物质的测定。

本试验采用了常见的C18柱，流动相组成简单，建立的测定各成分的HPLC法操作简便，而且灵敏度、精密度、准确性等均符合《中国药典》规定的要求。