奶牛子宫炎性腔液外泌体小RNA分布和组成分析

田 凤，常震宇，丁 进，李成忠，冯 妍，封紫嫣，倪和民，盛熙晖，齐晓龙，邢 凯，郭 勇，王相国*

(1. 北京农学院 动物科学技术学院，北京 102206；2. 北京雄特牧业有限公司，北京 100101；3.昌平区动物卫生监督管理局十三陵防疫站，北京 102200)

子宫内膜炎是奶牛围产期后由于多种细菌感染子宫内膜引发的一种严重影响奶牛业发展的疾病[1-2]。炎症的严重程度、子宫内膜损伤后恢复时间、子宫内膜腺体的损伤及输卵管环境改变严重影响了奶牛的繁殖活动[3]，其导致的奶牛屡配不孕，对养殖业造成了巨大的经济损失[4-5]。根据奶牛子宫内膜炎的症状分为卡他性、黏液性、纤维蛋白性、脓性子宫内膜炎和隐性子宫内膜炎[1-2]。目前，根据临床症状和分泌物的分析来判断子宫内膜炎的方法，不仅发现早期病变的速度慢，而且影响奶牛子宫内膜炎的早期治疗。因此，对子宫内膜炎疾病的早期诊断就显得尤为重要。

外泌体及其内含的小RNA，在不同疾病的进展中扮演者重要的角色。Taylor等[6]通过外泌体中小RNA的表达谱研究证实其差异表达可为卵巢癌疾病的预测提供依据。Cazzoli等[7]发现肺腺癌、肺肉芽肿患者外泌体内miR-378可以作为肺癌的生物标志物。Skog等[8]发现神经胶质外泌体内小RNA同样有差异表达。另有研究表明，外泌体及其小RNA还可作为疾病的一种治疗方法[9]。然而，外泌体及其小RNA在奶牛子宫内膜炎诊断中的诊断与应用尚鲜见报道。

本试验采用透射电镜、蛋白免疫等分子手段对健康和患病奶牛子宫腔液中外泌体进行验证，并通过基因组测序对外泌体中的小RNA的长度、分布比例及组成进行分析。对健康和患病奶牛小RNA的比较分析，为子宫内膜炎的预测及诊断方法提供新的参考。

1 材料与方法

1.1 研究对象

健康牛子宫和患有炎症的牛子宫各6个。4 ℃预冷的PBS冲洗子宫，收集腔液于离心管中，经0.22 μm滤膜过滤后置于-80 ℃冰箱。

1.2 方 法

1.2.1 仪器与试剂 外泌体提取试剂盒购自贝博公司；无水乙醇、氯仿、异丙醇购自北京化工厂；Trizol Reagent RNA提取试剂购自Invitrogen USA LTD；RNA ScreenTape 样品缓冲液购自安捷伦科技(中国)有限公司；透射电子显微镜；微量紫外分光检测系统购自Alphaspec Innotech；移液器购自Gilson；Agilent 4200 TapeStation购自安捷伦科技(中国)有限公司。

1.2.2 子宫腔液中外泌体的提取 采用贝博总外泌体提取试剂盒(Exo-IsoIation)从子宫腔液中提取外泌体，步骤如下：

首先收集4 mL待提取的子宫腔液样品，置于2～8 ℃保存。再将样品在4 ℃条件下，3 000 r/min离心15 min。弃沉淀后，收集上清。小心将上清液移入另一干净离心管中。将样品在4 ℃条件下，10 000 r/min离心20 min后，弃沉淀，收集上清。小心将上清液移入另一干净离心管中，在4 mL上清中加入1 mL提取液A，盖紧离心管盖，上下颠倒混匀1 min左右，使液体充分混匀。置于2～8 ℃冰箱静置过夜。(注：静置保存时间不少于10 h)在4 ℃条件下，10 000 r/min离心60 min。小心移除上清，收集沉淀。(尽可能吸干上清，吸取时，防止吸掉沉淀)取50～100 μL外泌体保存液将沉淀重悬，即得到外泌体样品。最后将外泌体样品保存于-80 ℃的冰箱中。

1.2.3 透射电子显微镜使用负染法对外泌体进行形态观察 首先选择干净的载玻片用Parafilm膜平整的粘在表面，其次将样品用100 μL的4 ℃PBS溶解混匀后，吸取40 μL样品滴于Parafilm膜上，形成一个均匀的液滴。用镊子将带有Formvar支持膜的铜网覆盖在样品滴上，使其漂浮3～5 min，根据样品可调整时间长短。用滤纸在液滴边缘将样品液吸去后，吸取50 μL的3%的磷酸钨染液滴于Parafilm膜上，1～2 min用滤纸将染液吸去。将染好的铜网放置在干净、划好分格线的平皿中干燥50 min后备用，透射电子显微镜观察。

1.2.4 蛋白免疫印迹法检测外泌体标志蛋白CD9表达 首先用 50 μL裂解液裂解贝博试剂盒提取的1 mL子宫腔液中的外泌体，进行12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)30 mA恒流电泳2 h。然后进行湿转法将SDS-PAGE凝胶上的蛋白转至NC膜上。其次用5%脱脂奶粉的含吐温20的PBS封闭液置于摇床，室温孵育1 h以上。加入CD9一抗(1∶1000稀释)，4 ℃过夜。次日，PBST洗膜(10 min，3次)后加入相应的二抗室温反应2 h。加入化学发光底物显色观察，使用照胶仪拍照。

1.2.5 子宫腔液外泌体总RNA提取 外泌体中总RNA提取步骤如下(试剂耗材需要提前高压灭菌，高温烘箱烘干，所有离心均是：4 ℃离心(12 000 r/min)10 min)：

首先将-80 ℃中保存的子宫腔液中提取的外泌体，常温溶解后，用1 mL的Trizol匀浆。冰盒放置5 min后，加入0.2 mL的氯仿，震荡，4 ℃放置2～3 min，离心。取出已经分层的悬浮液，吸取400 μL上层水相后转移至新管中，加入完成预冷的500 μL的异丙醇，冰上静置10 min，离心。吸出混合液，加入1 mL完成预冷的乙醇(75%)随后弹击EP管壁，使沉淀弹起。离心，弃乙醇。再次吸出混合液，加入1 mL完成预冷的乙醇(75%)随后弹击EP管壁，使沉淀弹起，离心。最后将上清液倒去，敞口在室温条件下通风干燥3～5 min，并加入20 μL RNA-free water，震荡混匀。

1.2.6 RNA测序 由上海欧易生物有限公司检测其样本。取Trizol裂解抽提的总RNA样品，经紫外分光光度计以及Agilent 生物分析仪检测其RNA浓度、纯度、以及完整性，符合测序质控标准后，制备cDNA文库。将cDNA文库用Illumin HiSeqTM2500测序平台进行检测，得到原始序列数据。最后测序得到的原始图像数据经base calling转化为序列数据。

1.2.7 Small RNA测序对样品中的总RNA进行定性和定量的测定 该方法能够得到原始reads，格式为fastq。第一，使用cutadapt[10]去除对接头序列。第二，使用fastx_toolkit (version 0.0.13)[11]软件，将Q20质控后的序列，保留将近80%。第三，使用NGSQCToolkit (version 2.3.2)[12]，过滤其中含有N碱基的reads，随后进行分析。将lean reads同Rfam (version 10.0)[13]数据库进行比对，根据结果，注释出不同种类的RNA序列。

2 试验结果

2.1 外泌体形态学鉴定结果

透射电子显微镜观察显示，无论从健康还是患子宫内膜炎奶牛子宫腔液中获得的外泌体均为大小不等的圆形至椭圆形囊泡状结构，可以见到清晰的膜结构。囊泡粒径大小多分布与50～150 nm，与文献报道的30～150 nm基本一致(图1)。

图1 子宫腔液外泌体电镜分析Fig.1 Electron microscopy analysis of exosomes in uterine cavity fluid

2.2 外泌体表面标记蛋白的表达鉴定结果

采用蛋白免疫印迹法检测外泌体标记蛋白CD9的表达(图2)结果显示，无论健康还是患子宫内膜炎奶牛子宫腔液来源外泌体均表达其表面特异性标记蛋白CD9。

图2 子宫腔液来源外泌体CD9蛋白表达Fig.2 CD9 protein expression in exosomes from uterine cavity fluid

2.3 外泌体中RNA的4200检测鉴定

将健康和患子宫内膜炎奶牛子宫腔液外泌体中提取的小RNA进行Agilent 4200生物分析仪检测，结果显示，miRNA条带较为清晰(图中标注约为50 bp)，表明样本中的RNA浓度和质量满足后续试验要求(图3)。

A1：健康牛，B1：患病牛图3 RNA的4200检测A1：cow with healthy，B1：cow with endometritisFig.3 RNA 4200 detection

2.4 外泌体中小RNA长度变化鉴定

样本中外泌体内小RNA经过clean reads的长度分布检测，结果显示，健康奶牛子宫腔液外泌体内小RNA的长度与患子宫内膜炎奶牛子宫腔液外泌体内小RNA的长度相比较，健康奶牛子宫腔液外泌体中小RNA的长度集中在30～31 nt，尤以31 nt较为密集，有9 483 354个；而患子宫内膜炎奶牛子宫腔液外泌体中的小RNA的长度则集中在30～32 nt，其中最大的变化是长度为32 nt的小RNA在健康中有647 490个，则在患子宫内膜炎外泌体中的小RNA有2 729 501个，有着极其显著的变化。但是患病来源外泌体中的小RNA长度为32 nt明显多于健康来源奶牛外泌体中的小RNA(图4)。

图4 子宫腔液exosomes外泌体中小RNA的长度分布图Fig.4 Length distribution of small RNA in exosomes

2.5 外泌体中各种小RNA的比例的鉴定结果

使用基因序列比较，经过统计reads进行对比，使用blastn软件，将不同种类结果中的提取E-value小于等于0.01的RNA进行注释。结果显示，与健康奶牛子宫腔液外泌体中的小RNA相比，患病奶牛子宫腔液外泌体中rRNA、tRNA、SnRNA、Cis-reg、repeat、gene与unannotation等都有下降趋势，尤其是repeat，从35 542下降至22 321。其中known-miRNA却是明显的上升，由1 073上升至1 245(图5)。

图5 外泌体中小RNA比例Fig.5 Proportion of small RNA in exosomes

3 讨 论

本研究发现，健康奶牛与患奶牛子宫内膜炎病的子宫腔液提取出的外泌体相比较，健康奶牛与患病奶牛外泌体直径大小差异不大，但是健康奶牛子宫腔液外泌体中小RNA的长度集中在长度为30～31 nt，尤其长度为31 nt较为密集；而患子宫内膜炎奶牛子宫腔液外泌体中的小RNA的长度则集中在30～32 nt。其中小RNA的各组成比例也发生了变化，为研发奶牛子宫内膜炎的早期诊断标记小RNA奠定了理论基础。

外泌体是一种双层膜结构的囊性小泡，在透射电子显微镜下观察直径为30～150 nm。外泌体在人体的体液中更加广泛的存在，其中包括常见的尿液、血液、乳汁等[14-15]。在受到细胞外刺激、微生物感染和其他应激等条件下都会影响外泌体分泌及组成成分[16]。研究证实[17-19]，外泌体在肿瘤诊断、迁移生长、组织损伤修复、免疫抗原递呈等方面都起着极其重要的作用。

目前为止，获取外泌体有很多方法，包括离心法、沉淀法、超滤法、免疫亲和法、微流控技术以及试剂盒提取等，每种方法都有不同的优缺点。离心法提取外泌体纯度高但却费时费力，极易影响后续试验[15-16]；沉淀法使用十分方便，不需要专业设备，但杂蛋白污染多，且试剂昂贵；超滤法操作简单，快速，但回收率低且蛋白污染严重[20-21]；免疫亲和法提取外泌体亲和度和纯度极高，但仅仅适用于无细胞样品。本试验采用的试剂盒提取的外泌体，操作简单，纯度高，能够满足本试验的要求。

外泌体中的小RNA在疾病中发生和发展中的作用，越来越受到研究者的关注[22-23]。外泌体作为小RNA在细胞间的运输载体也是研究的热点之一[24]。本研究中发现，子宫内膜炎症影响了子宫腔液中外泌体小RNA的组成和长度分布，通过健康奶牛和患病奶牛子子宫腔液外泌体中的小RNA的测序结果发现，患病子宫内膜炎外泌体中的小RNA的组成和小RNA的长度分布与健康奶牛中外泌体有着明显的差异。

总之，本研究证实奶牛患子宫内膜炎症改变子宫腔液外泌体中的小RNA的密集长度以及分布比例的变化，为将外泌体内小RNA应用于奶牛子宫内膜炎的早期诊断奠定了理论基础。