森林草莓‘Hawaii 4’继代培养与遗传转化条件的优化

韦航涛，马伯宁，项 晨，刘 佳，杨明峰

(北京农学院 生物与资源环境学院/农业部华北都市农业重点实验室，北京102206)

草莓(Fragaria×ananassaDuch)是蔷薇科草莓属多年生草本植物，其果实香甜可口，是一种深受欢迎的水果[1]。草莓营养价值丰富，被誉为“水果皇后”，含有多种维生素、胡萝卜素、氨基酸等营养物质，尤其是维生素C含量比苹果高7～10倍。草莓容易栽培、管理简单，但传统的栽培方式周期长、繁殖慢、易感染病毒[2]。因此优化草莓组织培养条件具有十分重要的意义，它既可以快速繁殖出高品质草莓苗也避免营养繁殖及连作带来的病毒积累的问题，同时也是草莓遗传转化的前提。优化草莓遗传转化体系具有很重要的应用价值，可以有目的的改良草莓的品质，从而得到常规育种难以得到的优质草莓，为草莓的选育栽培及农业化生产作出贡献[3]。

草莓的转基因研究始于20世纪80年代，并且已经成功获得转基因草莓株系[4]。目前通过农杆菌介导法获得的转基因草莓植株具有抗病虫害、抗寒、抗旱等优良性状[5]。周鹤莹[6]以森林草莓‘Hawaii 4’为试验材料，通过农杆菌介导法得到阳性植株，转化效率仅为18%，其组织培养条件和遗传转化条件还有待进一步优化。本研究以‘Hawaii 4’的叶片为试验材料，对草莓的组织培养和遗传转化条件进行了探索，得到草莓苗的组培快繁和高效遗传转化的条件，为高品质草莓品种的选育及其研究奠定了技术基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

植物材料：二倍体森林草莓品种‘Hawaii 4’(Fragariavesca，2n=2x=14)。农杆菌菌株：EHA105。植物表达载体：pCAMBIA3301-121(含有植物除草剂草铵膦筛选标记)。

1.2 无菌材料的获得

将草莓种子浸入75%乙醇30 s，无菌水洗3遍，然后浸入2%的NaClO 10 min，再用无菌水洗3遍。然后将种子表面的残留水分用滤纸吸干并接种于1/2 MS培养基。

1.3 草莓最佳继代培养基的选择

为了改良草莓继代培养的条件，从继代培养基的培养基种类、培养基pH值、含糖量(蔗糖)、琼脂量进行筛选，进而对草莓组织培养条件进行优化。不同条件每组转接7瓶，重复3组。

1.4 草莓遗传转化条件的优化

1.4.1 草铵膦压力筛选 pCAMBIA3301-121是带有抗除草剂Bar基因的植物表达载体。为保证筛选出阳性抗性植株，将草铵膦浓度设为1.0、2.0、3.0 mg/L。

1.4.2 草莓叶片脱分化和再分化的遗传转化系统 在不同激素配比的培养基中接种不同叶龄的草莓叶片。用不同浓度的TDZ和6-BA来诱导叶片脱分化，不同浓度IBA和IAA来诱导愈伤组织分化成芽。每周观察接种后叶片愈伤组织的生长情况及其分化再生情况。30 d后统计草莓叶片的出愈率和愈伤组织的分化率。

1.4.3 草莓转化条件筛选 将带有载体pCAMBIA3301-121的农杆菌EHA105进行划线活化，并取单菌落在2 mL LB培养基中培养，菌液梯度为OD600=0.4～0.8；取0.8 mL菌液5 000 r/min离心5 min，用20 mL MS悬浮；农杆菌侵染预培养叶片的时间梯度为10、15、20 min；共培养2 d后用500 mg/mL的Carb进行脱菌培养。待愈伤组织分化成芽后，在含有草铵膦的筛选培养基上进行阳性植株的筛选培养并分析抗性植株的成活率。

2 结果分析

2.1 草莓‘Hawaii 4’继代培养结果

2.1.1 基本培养基对草莓继代培养的影响 选用MS和1/2 MS作为基本培养基，从株高和形成芽数上看，1/2 MS培养基植株株高相对较高，形成芽数相对较多(表1)。因此1/2 MS更适合森林草莓的继代培养。

表1 基本培养基浓度对森林草莓生长的影响Tab.1 Effect of basic medium concentrations on the growth of woodland strawberry

注:不同字母表示差异极显著(p<0.01)，表2 同

Note：Different letters indicated significant difference(p<0.01),and it is applied to Tab. 2

2.1.2 pH值对草莓继代培养的影响 pH值主要影响培养基的硬度，以此来影响草莓的长势。基本培养基在1/2 MS的基础上选择的pH值为5.4、5.6、5.8和6.0。pH 5.4和pH 5.6的硬度较差，草莓长势一般，pH 5.8效果最好，pH 6.0硬度太强并不利于草莓生长(表2)。

2.1.3 糖含量对草莓继代培养的影响 选择了3种不同含糖量的1/2 MS培养基。由结果可以看出，培养基中含10 g/L的糖时草莓长势最高，其次为20 g/L，而30 g/L的长势较差(表2)。糖的含量过多不利于草莓的生长。

表2 pH,糖浓度和琼脂含量对森林草莓生长的影响Tab.2 Effects of pH,sugar concentrations,and agar on the growth of woodland strawberry

2.1.4 琼脂量对草莓继代培养的影响 选择了三种不同琼脂含量的1/2 MS培养基。琼脂量7 g/L形成芽数最多，其余含量结果差异不明显(p>0.05)；从株高上看，琼脂量为6 g/L时植株最高，7 g/L时次之；但从培养基硬度上看，7 g/L效果最好(表2)。

2.2 草莓的草铵膦压力筛选

草铵膦为1 mg/L处理茎端，生长趋势受到抑制，叶片泛黄；2 mg/L时，30 d左右茎端枯萎死亡；3 mg/L时14 d茎端死亡(图1)。草铵膦2 mg/L为最佳筛选浓度，是达到足够筛选压力的合适浓度。

2.3 草莓叶片脱分化和再分化的遗传转化系统

将刚展开的叶片进行脱分化和再分化培养，脱分化成愈伤组织的培养基激素配比为3.0 mg/L的6-BA和0.2 mg/L的IBA。愈伤组织再分化成芽的培养基激素配比为3.0 mg/L的6-BA和0.2 mg/L的IBA(表3)。

A.1 mg/L；B.2 mg/L；C.3 mg/L图1 不同浓度草铵膦对森林草莓生长的影响Fig.1 Different concentrations of herbicide on the growth of woodland strawberry ‘Hawaii 4’

表3 不同激素配比对诱导愈伤组织的影响Tab.3 Effects of hormone compositions on callus formation

2.4 草莓转化条件筛选

通过农杆菌侵染叶片(图2-A)，脱分化成愈伤组织(图2-B)，愈伤组织分化成芽(图2-C)，在含有草铵膦的筛选培养基上进行阳性植株的筛选培养得到抗性苗(图2-D)，最后分析抗性植株的成活率。共侵染40片草莓叶片，脱分化得到38个愈伤组织，分化得到再生芽38株，经过草铵膦抗性压筛选得到阳性植株35株，转化率为87%。遗传转化结果为：理想的农杆菌菌液浓度OD600=0.6侵染15 min；培养基添加500 mg/L的Carb进行脱菌培养。

A.叶片诱导愈伤组织；B.愈伤组织；C.愈伤组织分化；D.生根培养图2 森林草莓遗传转化过程A.Leaf-induced callus; B.Callus; C.Callus differentiation; D.Rooting cultureFig.2 Genetic transformation process of woodland strawberry ‘Hawaii 4’

3 讨 论

优化草莓组织培养条件和建立高效稳定的草莓遗传转化体系是快速繁殖草莓苗、培育高品质草莓品种的关键。二倍体草莓基因组小、生长周期短、易于栽培、容易再生且与高倍体食用草莓亲缘关系近，本试验以二倍体草莓‘Hawaii 4’为材料优化了森林草莓的组织培养和遗传转化条件。

草莓的遗传转化效率受许多条件的影响[7]，其中包括内部基因调控和植物外界环境的影响。不同激素种类与配比影响也较大[8]。生长素促进植物根的生长，细胞分裂素则促成茎的生成，两者的不同浓度配比可以诱导芽的生成。Nehra[9]用6-BA和IBA诱导‘Redcoat’草莓叶片再生成芽，得到了6.5%的转化率。冯利[10]用0.5 mg/L 6-BA 对‘红颊’草莓进行初代和继代培养，用1.0 mg/L 6-BA和0.3 mg/L IBA进行芽的诱导,不定芽再生率为77.8%。乔瑞琪等[11]以‘Ruegen’草莓叶片为试验材料，选用2.0 mg/L的TDZ和0.2 mg/L的IBA，使草莓的不定芽再生率达到81.03%。TDZ是具有细胞生长素和细胞分裂素分裂双功能的激素，它能够使难以分化的植物分化[12]，但TDZ浓度过高会抑制愈伤组织分化并加快叶片死亡[13]。而6-BA则有利于愈伤组织分化且浓度过高不会导致叶片死亡。本研究在激素浓度配比方面选用6-BA和IBA两种植物生长调节剂，在1/2 MS培养基上添加3.0 mg/L 的6-BA和0.2 mg/L IBA进行诱导再生培养，草莓‘Hawaii 4’的不定芽再生率达到87.0%。高于其他草莓品种的不定芽再生率。

草莓转基因研究的方法主要有电转化法，农杆菌介导法等[14]，在农杆菌介导法中，侵染菌液的OD值、侵染时间是决定转化效率的关键因素[15]。张红梅和王俊丽[16]使用农杆菌对‘全明星’草莓叶片的进行了遗传转化研究，认为菌液浓度OD600=0.5，侵染时间5～15 min都可取得比较理想的转化效果。森林草莓‘Hawaii 4’理想的菌液浓度和侵染时间与‘全明星’草莓相似，理想的菌液浓度和侵染时间显著提高了草莓的遗传转化效率。

本研究综合比较各种不同的试验处理，成功优化了森林草莓‘Hawaii 4’组织培养条件和遗传转化条件，加快了草莓苗扩繁速度，也为草莓基因工程研究提供了重要参考。