膜性肾病患者临床病理特点及外周血T及Th细胞亚群分析

(保定市第二中心医院1.血液肾病科，2.血透室，河北 保定072750)

膜性肾病是原发性肾小球肾炎中最常见的病理类型，近年来发病率呈逐年上升趋势[1]。流行病学研究显示，约30%的膜性肾病患者5年内病情自行缓解，70%的患者表现为持续性蛋白尿，半数以上的患者8～12年发展为终末期肾病[2]。免疫抑制剂是目前治疗膜性肾病的主要方案，但由于膜性肾病患者病情转归的不同，导致免疫抑制剂的应用存在较大争议[3]。准确评估膜性肾病患者临床病理特点及免疫功能状况，筛选出可能进入终末期肾病的患者，对治疗方案的选择具有重要意义。本研究根据24 h蛋白尿、血清白蛋白水平将膜性肾病患者分为中高危组、低危组，分析病理分期、肾小球球性硬化、IgG等病理特点；并以健康志愿者为对照，分析T及Th细胞亚群水平，旨在为膜性肾病治疗方案的选择及免疫失衡机制的阐明提供参考。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2017年6月至2018年10月间本院收治的膜性肾病患者100例。入选标准[4]：①年龄≥18岁，经肾组织活检确诊为膜性肾病；②无环磷酰胺、糖皮质激素、环孢素等免疫抑制剂或细胞毒性药物服用史。排除标准[5]：①合并自身免疫性疾病、过敏性哮喘；②合并感染性疾病、恶性肿瘤、严重心脑血管疾病；③血肌酐>309 μmol/L，或合并威胁生命的肾病综合征并发症。根据24 h蛋白尿、血清白蛋白水平分为中高危组(24 h蛋白尿≥4 g，血清白蛋白≤20 g/L)78例，低危组(24 h蛋白尿<4 g，血清白蛋白>20 g/L)22例。高危组中男性54例，女性24例；年龄26～65岁，平均年龄(48.59±12.64)岁。低危组中男性17例，女性5例；年龄24～68岁，平均年龄(49.02±11.90)岁。选取同期体检的健康志愿者66名为对照组，其中男性56例，女性10例；年龄25～62岁，平均年龄(48.85±12.03)岁。三组受试者性别、年龄之间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经伦理委员会批准，受试者签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 肾组织病理指标检测 ①光学显微镜观察：取肾活检组织，10%甲醛固定后常规石蜡包埋，4 μm连续切片，分别行HE染色、过碘酸六胺银染色、过碘酸-雪夫反应、Masson染色；光学显微镜下观察病理分期、肾小球球性硬化、肾小球节段硬化、新月体、间质炎性细胞浸润、肾小管急性病变区[6]。②免疫荧光检测：取肾组织进行冰冻直接切片，5%胎牛血清封闭20 min，磷酸缓冲液洗涤，滴加鼠抗人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4单克隆抗体，均为1∶500稀释，37 ℃孵育2 h，滴加山羊抗鼠IgG，1∶1 000稀释，37 ℃孵育40 min，置于荧光显微镜下观察。

1.2.2 外周血单核细胞分离 收集受试者空腹肘静脉血4 mL，抗凝处理后与5 mL DMEM培养基混合均匀，加入淋巴细胞分离液，3 000 r/min离心30 min，吸取上层与中层交界处的外周血单核细胞，加入10 mL DMEM培养基，2 000 r /min离心10 min，除去淋巴细胞分离液；用含10%胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞，计数后调整细胞浓度为1×106/mL，分装入流式细胞管中保存待用，每管中细胞数为1×106个。

1.2.3 外周血单核细胞中Th细胞亚群检测 取10 μL外周血单核细胞悬液，滴加10 μL 0.2%台盼蓝计数，光学显微镜下观察细胞活性并计数；余下的外周血单核细胞悬液以2 000 r/min离心10 min，收集细胞，使用DMEM完全培养基重悬细胞并调整细胞密度为1×106个/mL于流式细胞管中。设置同型对照管、试验管，每管中加入5 μL anti-CD4 (FITC)，室温下避光静置30 min，磷酸缓冲液洗涤后，2 000 r/min离心10 min，去除上清，滴加600 μL固定和透化溶液(Fixation/Permeabilization Solution)，避光反应30 min；加入5 mL配制好的BD Perm/Wash洗涤、2 000 r/min离心后去除上清，向试验管中滴加5 μL的anti-IFN-γ-FITC、anti-IL-9-PE、anti-IL-4-APC，同型对照管中滴加anti-IgG1-PE、anti-IgG1-APC各2 μL，避光反应40 min，多聚甲醛固定后上流式细胞仪检测。

1.2.4 外周血中T细胞检测 设置同型对照管、试验管，分别取400 μL抗凝处理后的肘静脉血，均加入Anti-CD4 (PerCP)、Anti-CD25 (APC)各10 μL，室温下避光反应30 min；每个流式细胞管中分别加入溶血素3 mL，避光静置20 min，加入1 mL磷酸缓冲液洗涤，2 000 r/min离心10 min，去除上清，加入1 mL Fixation/Permeabilization Solution固定、通透，避光静置90 min，加入2 mL的Permeabilization Buffer，2 000 r/min离心10 min，去除上清，滴加Anti-FOXP3-PE 10 μL，同型对照管滴加Anti-IgG-PE 10 μL，室温下避光反应30 min，多聚甲醛固定后上流式细胞仪检测。

1.3 统计学分析

数据以均数±标准差、百分比表示，进行方差分析、t检验、χ2检验，使用SPSS21.0处理，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组患者病理检查指标比较

间质炎性细胞浸润、肾小管急性病变区在中高危组与低危组之间差异有统计学意义(P<0.05)，中高危组间质炎性细胞浸润、肾小管急性病变区范围明显大于低危组。病理分期、肾小球球性硬化、肾小球节段硬化、新月体在两组患者间差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。电镜下可见两组患者肾小球基底膜均增厚，上皮下及系膜区有电子致密物沉积。见图1。

2.2 各组患者IgG不同亚型沉积情况分析

膜性肾病患者中IgG4荧光强度最高，IgG2荧光强度最弱，见图2。同一患者IgG不同亚型中荧光强度最强定义为IgG亚型主沉淀。中高危组患者中IgG4为主沉淀的比例最高，且明显高于低危组(P<0.01)；低危组患者中IgG1主沉淀的比例最高，且明显高于中高危组(P<0.01)；低危组患者中IgG2、IgG3主沉淀的比例明显高于中高危组(P<0.05)。见表2、图2。

表1 中高危组与低危组患者病理检查指标比较 (例,%)

图1 电镜下观察肾小球基底膜增厚(15000×)

表2 各组患者IgG亚型主沉积情况比较 (例,%)

图2 两组患者免疫荧光IgG不同亚型沉积情况

2.3 各组患者外周血T及Th细胞亚群情况分析

T细胞亚群中CD3+CD45+、CD3+CD4+、CD4+/CD8+在各组间差异有统计学意义(P<0.05)；中高危组和低危组CD3+CD45+、CD3+CD4+、CD4+/CD8+明显高于对照组(P<0.05)。Th细胞亚群中Th9、Th1、Th2、Th2/Th9在各组间差异有统计学意义(P<0.05)；Th9、Th1、Th2水平明显高于对照组，Th2/Th9明显低于对照组(P<0.05)。见表3。

表3 各组患者外周血T及Th细胞亚群情况分析

与对照组比较，aP<0.05；与低危组比较，bP<0.05

3 讨 论

膜性肾病是最常见的原发性肾小球肾炎之一，发病率仅次于IgA肾病[7]。膜性肾病患者的临床自然转归存在较大差异，准确评估患者病理特点及免疫情况，预测可能发展为终末期肾病的高危患者，对临床治疗方案的制定具有重要意义。本文根据24 h蛋白尿及血清白蛋白水平将膜性肾病患者分为中高危组、低危组，比较临床病理特点。结果显示，膜性肾病患者病理分期以Ⅱ期为主，但中高危组与低危组之间无明显差异。相关研究显示，高龄、高血压、肾功能减退的膜性肾病患者病理分期较高[8]。目前膜性肾病分期与症状及实验室指标间的关系仍存在较大争议，需进一步大样本量深入研究。中高危组间质炎性细胞浸润、小管急性病变区的范围均明显高于低危组，提示尿蛋白量越大，膜性肾病患者肾脏急性和慢性病变程度越严重；根据蛋白尿分级可用于膜性肾病预后评估。IgG包括4种亚型，其中IgG4与膜性肾病的发生与发展关系最明显,研究者发现，IgG4是抗磷脂酶A2受体抗体与1型血小板反应蛋白7A域的特异性抗体，是鉴别特发性膜性肾病与继发性膜性肾病的主要标志物。膜狼疮性肾炎存在IgG1、IgG2、IgG3、IgG4高表达[9]。本研究以特发性膜性肾病患者为研究对象，IgG亚型中以IgG4荧光强度最高，IgG2荧光强度最弱。中高危组以IgG4为主要亚型沉积，低危组以IgG1为主要亚型沉积。研究者发现，膜性肾病不同发病期的主要IgG亚型沉积存在差异，发病早期以IgG1为主要沉积[10]，而IgG4通过经典途径对补体的激活能力弱，早期水平偏低，发病晚期在肾小球皮下沉积[11]。

正常状态下T细胞亚群可维持一定数量和比例，机体免疫功能处于正常状态；当T细胞亚群之间平衡失调会引发细胞因子分泌异常，导致免疫失调[12-13]。本研究显示，中高危组患者CD3+CD4+、CD4+/CD8+水平明显高于对照组，且CD3+CD8+呈下降趋势，与相关研究报道一致[14]；提示膜性肾病患者外周血T细胞亚群以CD4+T细胞水平升高为主，CD4+/CD8+比值增加。但上述改变也存在于IgA肾病[15]，因此CD4+/CD8+变化不能作为膜性肾病的特异性表现。研究者对IgA肾病患者外周血Th1、Th2研究显示，Th2水平明显提升，且与24h蛋白尿呈正相关，但Th1未出现明显改变，存在Th1/Th2平衡失调[16]。之后研究者从膜性肾病患者外周血单个核细胞中分离纯化得到B细胞，与IL-4、IL-10等细胞因子在体外进行共培养，酶联免疫吸附法检测IgG亚型发现B细胞与Th2分泌的IL-4共培养后，IgG4较其他研究组明显提升[17]。亦有研究者对ANCA相关性肾炎、膜性肾病患者的肾组织行RT-PCR检测显示，IL-4 mRNA主要沉积于膜性肾病，且与IgG4呈正相关[18]。上述研究分别从体外分离细胞和肾组织层面上证实了膜性肾病主要以Th2细胞反应为主，进而促进IgG4分泌。本研究中膜性肾病患者外周血Th1、Th2细胞因子均明显低于正常对照组，且Th1/Th2呈下降趋势，低危组趋势最明显；与相关研究报道一致[19]；提示膜性肾病患者存在Th1/Th2平衡失调。以往对肾病患者的研究多集中于CD4+/CD8+、Th1/Th2，对Th9的研究较少[20-21]。Th9具有多种生物学活性，与Th细胞亚群相关，其中与Th2关系最明显[22]。本研究显示，膜性肾病患者外周血Th9明显高于对照组，且中高危组明显高于低危组，膜性肾病患者Th2/Th9明显低于对照组。提示膜性肾病患者存在Th9细胞反应，且Th2向Th9偏移，Th9过表达与膜性肾病发展有关。