亚硝酸钠对大鼠高肺血流肺动脉高压的治疗作用及可能机制

(1.如皋市人民医院呼吸内科，江苏 如皋226500；2.南通市第一人民医院呼吸内科，江苏 南通226000； 3.南通大学附属医院呼吸内科，江苏 南通 226000)

肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension,PAH)是一种预后较差的血管疾病[1]。高肺血流肺动脉高压是先天性心脏病最常见的并发症，又称为先心病肺动脉高压，表现为肺血管床结构和/或功能改变，导致肺血管阻力和肺动脉压力进行性增高[2]。高肺血流肺动脉高压会导致右室扩张，引起心力衰竭，甚至患者死亡[3]。对于NO信号通路的干预已被用于肺动脉高压的治疗，持续吸入NO是目前肺动脉高压的重要治疗方法。亚硝酸盐(nitrite)以前被认为是NO的一种无活性代谢产物。随着研究进展，越来越多的学者认为亚硝酸盐具有重要的生理及病理生理功能[4]。本研究探讨亚硝酸钠(NaNO2)治疗高肺血流肺动脉高压大鼠的效果及可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取SPF级成年SD雄性大鼠36只，体重(215.4±9.0)g，喂养于室温23 ℃～25 ℃、相对湿度45%～60%、光照12h的环境中。

1.2 实验药品

食品级亚硝酸钠(批号：20121013)，购自上海科昌精细化学品公司；一氧化氮试剂盒(酶法)，购自北京奥维亚生物技术有限公司。兔抗大鼠NF-κB抗体购自美国Abcam公司；兔抗大鼠TGF-β1抗体、兔抗大鼠VEGF抗体购自美国Biowofld公司，驴抗兔IgG工作液购自上海沪峰化工有限公司；总蛋白提取试剂盒购自上海碧云天生物技术研究所。

1.3 实验方法

1.3.1 分组及建模 选取清洁级成年SD雄性大鼠36只，采用随机数字表法分为对照组、模型组和治疗组，每组各12只，模型组和治疗组参照文献方法建立大鼠高肺血流肺动脉高压模型[5]，对照组仅采取假手术。具体方法如下：实验大鼠术前禁食12h，使用10%水合氯醛腹腔注射进行麻醉，大鼠仰卧固定于鼠板上。大鼠腹部旁正中切口，打开腹腔，暴露腹主动脉和下腔静脉。采用腹主动脉-下腔静脉分流手术建立高肺血流肺动脉高压大鼠模型，在该段腹主动脉中下1/3处，使用静脉穿刺针穿入腹主动脉以及腹主动脉-下腔静脉联合壁，形成瘘口。使用粘合剂封住穿刺口。分流模型建立成功后，复位腹腔内脏器，关闭腹腔。

1.3.2 干预方法 治疗组给予NaNO23mg/kg灌胃，1次/天，连续3周。模型组和对照组仅给予等量生理盐水灌胃，末次给药结束24 h后进行以下指标检测。

1.4 观察指标及检测方法

1.4.1 大鼠肺动脉HE染色 取大鼠右肺上2叶肺组织，给生理盐水及4%多聚甲醛灌注固定。经石蜡包埋，切片做HE染色。

1.4.2 血流动力学指标测定 大鼠腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉，固定于小动物手术台上。经颈正中切口行气管切开，接TKR-200C型小动物呼吸机(江西特力麻醉呼吸机设备公司)，潮气量2 mL/100 g、呼吸频率40次/min。暴露左颈总动脉，连接压力传感器及PM-9000多导生理记录仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)，稳定后记录平均肺动脉压力(MPAP)、平均右心室内压(MRVP)、右室收缩压(RVSP)。记录完毕后，处死大鼠，采集肺动脉血样3～4 mL，4 ℃下以3000 r/min离心10 min，取上清液，置于-80 ℃保存待测；取出大鼠心脏，用小手术剪剪去心房组织，分离右心室、室间隔+左心室。冲洗，吸干水分，称重。计算右心室肥厚指数(right ventricular hypertrophy index, RVHI)。公式如下：右心室质量/(左心室+室间隔)质量=右心室肥厚指数。

1.4.3 血清及肺匀浆组织中NO含量测定 血流动力学指标记录完毕后，处死大鼠，采集肺动脉血样3～4 mL，4 ℃下以3000 r/min离心10 min，取上清液，置于-80 ℃保存待测；称取右肺上叶肺组织，制备10%肺匀浆。根据一氧化氮试剂盒(酶法)的说明书测定血清及肺匀浆组织中NO水平。

1.4.4 肺组织中的NF-κB、TGF-β1、VEGF蛋白表达测定 免疫组化方法检测肺组织中核转录因子(nuclear factor-κB，NF-κB)、转化生长因子β1(transforming growth factor beta，TGF-β)、血管内皮生长因子((vascular endothelial growth factor，VEGF)蛋白的表达。将切片置入二甲苯中脱蜡(10 min×3次)、梯度乙醇水化处理(10 min×3次)，S-P法检测，使用3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，室温留置15分钟以封闭内源性过氧化物酶。3%牛血清清蛋白封闭1h处理，然后分别滴加1∶100兔抗大鼠NF-κB抗体、兔抗大鼠TGF-β1抗体、兔抗大鼠VEGF抗体，4℃过夜。PBS冲洗3次每次3分钟，滴加生物素标记的驴抗兔IgG工作液(上海沪峰化工有限公司)，室温孵育1 h。PBS冲洗3次每次3分钟，滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素，孵育1h。新鲜配制DAB溶液，显色处理，自来水冲洗。苏木素复染，自来水冲洗。切片经过梯度酒精干燥，二甲苯透明，之后使用中性树胶封固。脱色后，在显微镜下观察处理。

1.5 统计学方法

2 结 果

2.1 各组大鼠肺动脉病理学形态观察

在HE染色后，光镜下观察，对照组大鼠肺动脉壁薄且光滑、内皮细胞外形扁平；肺动脉高压组大鼠肺动脉内膜及中膜显著肥厚，平滑肌细胞较对照组明显增多且排列比较紊乱，肺动脉的管腔变的较为狭窄，可见较多的炎性细胞浸润；治疗组的上述情况较模型组均有显著的改善(图1)。

图1 各组大鼠肺动脉重构结果(HE 400×)

2.2 各组大鼠的血流动力学指标

干预3周后，模型组大鼠的MPAP、MRVP、RVSP、RVHI测定值均高于对照组(P<0.05)；治疗组大鼠的MPAP、MRVP、RVSP、RVHI测定值均低于模型组(P<0.05)(表1)。

表1 各组大鼠的血流动力学指标比较

与对照组比较,aP<0.05；与模型组比较,bP<0.05

2.3 各组大鼠的血清及肺匀浆液中的NO水平

干预3周后，模型组大鼠的血清NO测定值低于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)；治疗组大鼠血清NO测定值高于模型组(P<0.05)；对照组、模型组和治疗组肺组织匀浆液中NO含量差异无统计学意义(P>0.05)(表2)。

表2 大鼠的血清及肺匀浆液中的NO含量比较

与对照组比较,aP<0.05；与模型组比较,bP<0.05(n=12)

2.4 各组大鼠肺组织中NF-κB、TGF-β1、VEGF蛋白表达

干预3周后，模型组大鼠肺组织中NF-κB蛋白，TGF-β1、VEGF蛋白表达高于对照组(P<0.05)；治疗组肺组织中NF-κB蛋白、TGF-β1、VEGF蛋白表达显著低于模型组(P<0.05)，其蛋白表达见图2，相对表达量见表3。

图2 大鼠肺组织中NF-κB、TGF-β1、VEGF蛋白表达

组别NF-κBTGF-β1VEGF对照组0.5±0.10.42±0.10.6±0.2模型组1.1±0.4a1.69±0.4a1.2±0.4a治疗组0.8±0.3ab0.8±0.3ab0.8±0.2abF43.06529.87531.164P0.0000.0000.000

与对照组比较,aP<0.05；与模型组比较,bP<0.05(n=12)

3 讨 论

肺动脉高压是指肺动脉压力升高超过一定界值并导致右心室衰竭为特征的一种疾病[6]。先天性心脏缺陷引起的肺动脉高压是儿童先天性心脏病最常见并发症之一。肺小动脉进行性狭窄导致肺动脉持续增高，右心压力负荷过重、右心衰竭。肺小动脉血管重构是肺动脉高压最基本的病理特征，先天性心脏病引起肺动脉高压的发病机制涉及多个方面。多数研究表明，肺动脉高压的发展与血管舒张因子和血管收缩因子的失衡有关[7-8]。NO吸入作为一种选择性的肺血管扩张剂，是目前肺动脉高压的重要治疗方法。但是，NO吸入治疗设备昂贵，NO作用时间较短，仪器操作相对复杂，因此在临床的应用受到一定限制。

亚硝酸盐是一种无机阴离子，以往研究认为亚硝酸盐是NO的一种无活性代谢产物。目前有研究发现，亚硝酸盐会通过某些途径重新被机体利用还原成NO[9]。NO是以氧依赖的L-精氨酸作为底物，一氧化氮合酶(NOS)催化下产生。Sitbon等研究显示，当机体的NOS-NO途径无法正常产生NO时，NO不通过经典的NO途径生成，而由亚硝酸盐还原产生[10]。研究显示，亚硝酸盐具有一定的血管扩张效应，能导致血管舒张，降低血压[11]。袁瑞雪等研究发现，在大鼠的肺动脉高压模型中，亚硝酸盐有肺血管扩张和产生血管重塑的治疗作用[12]。本研究结果显示，通过在腹主动脉和下腔静脉之间进行造瘘手术，能成功建立高肺血流肺动脉高压大鼠模型，给予NaNO2干预3周后，治疗组大鼠的MPAP、MRVP、RVSP、RVHI测定值均显著降低，表明NaNO2对高肺血流肺动脉高压大鼠具有显著的降压效果，并能减轻肺动脉血管和右心脏重构，与Jain等之前报道的结果相一致[13]。另外，NaNO2干预3周后，治疗组大鼠血清NO测定值均显著的高于模型组，表明肺动脉高压大鼠MPAP降低与亚硝酸盐转化为NO产生血管扩张作用有关。

血管内皮细胞可以分泌特定的生长因子如VEGF、TGF-β等[14]，其分泌紊乱可以导致血管内皮细胞能紊乱、增殖和凋亡失衡，直接促进肺小动脉血管重构。NF-κB是一种调节各种生物现象的关键转录因子，可以调节TGF-β1、VEGF的表达，促进血管重构[15]。本研究发现干预3周后，治疗组肺组织中NF-κB、TGF-β1、VEGF蛋白表达显著低于模型组，说明NaNO2可以降低NF-κB、TGF-β1、VEGF蛋白表达，其机制可能与调节NF-κB信号通路的活性有一定关联。

综上所述，NaNO2对高肺血流肺动脉高压大鼠具有显著的降低肺动脉高压效果，减轻肺动脉血管和右心脏重构、其作用机制可能与调节肺组织中NF-κB、TGF-β1、VEGF及NO水平有关，值得在临床进一步探讨。