生姜对小鼠肠道菌群及局部免疫功能的调节作用

陶 俊，寇 硕，唐小云

(1.牡丹江医学院；2.牡丹江医学院病原教研室，黑龙江 牡丹江 157011)

生姜是姜科植物姜的新鲜根茎，其性味辛温，具有祛风、解表、和胃、温经止痛的功效，是我国中医药常用的药食两用的材料，素有“生姜治百病”、“冬吃萝卜夏吃姜”之说。生姜除了作为食品加工过程中的主要佐料，在民间还被广泛应用于治疗风寒感冒、头痛鼻塞、呕吐、风湿性关节炎、便秘，以及用于食物防腐等方面[1]。

人体的消化道是营养吸收的主要途径，也是治疗用药最方便和最主要的途径。生姜最方便的使用途径就是直接食入经消化道发挥作用。而消化道寄生着大量的微生物，据估计人体结肠细菌数量为3.8×1013个，比身体其他部位正常菌群总量至少高2个数量级，因此可以把结肠细菌数量看作人体细菌的总量[2]。这些微生物在正常情况下和机体形成共生的关系，对机体有益无害，具有拮抗致病菌、免疫促进、营养、抗肿瘤等作用。

消化道用药一方面要考虑到对消化道细菌的影响，另一方面要考虑消化道细菌对药物的作用。生姜作为临床常用中药，经过消化道给药，对肠道菌群的影响却少见报道。因此本实验通过给小鼠灌胃生姜煎煮液，观察生姜对小鼠肠道菌群的影响，并进一步研究生姜对小鼠肠道局部免疫功能的影响。

1 材料与方法

1.1 生姜煎煮液的制备取生姜100g，除去泥沙和杂质，洗净切片，加10倍量水煎煮1h，用纱布滤出药液。滤渣再加水反复煎煮3次，每次过滤取滤液。最后合并4次滤液，并浓缩至浓度为0.25g/mL、0.5g/mL、1g/mL。

1.2 试剂IL-2 ELISA试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；SIgA ELISA试剂盒购自北京尚柏生物医学技术有限公司；Oxoid酵母粉购自上海根生生物科技有限公司；无菌均质袋、2.5 L厌氧产气包、EMB琼脂培养基(伊红美兰培养基)、EC(肠球菌)琼脂、LBS(乳酸杆菌培养基)琼脂、BS(双歧杆菌)琼脂均购自青岛海博生物技术有限公司。

1.3 动物分组及处理昆明鼠40只，体重18～22g，雌雄各半，由牡丹江医学院实验动物中心提供，随机分为4组，每组10只。NC 组为正常对照组，每日灌胃蒸馏水0.25mL，连续15d。H、M、L 3组为生姜高、中、低剂量组，参照王慧芳等[3]报道，每日分别灌胃浓度为1g/mL、0.5g/mL 、0.25g/mL生姜煎煮液 0.25mL，每日1次，连续15d。

表1 肠道细菌培养基和稀释度的选择及其他培养条件

1.5 肠粘膜表面SIgA的检测无菌取靠近回盲部的肠段1.5cm，纵向剖开，用生理盐水反复冲洗肠腔表面后，用载玻片轻刮黏膜表面黏液至EP管中，再加入0.01mol/L的PBS 0.5mL，充分混匀后，10000rpm离心15min，吸取上清-20℃保存待测。肠粘膜SIgA的检测采用ELISA法，具体操作按试剂盒说明书进行。

1.6 肠组织IL-2的检测无菌取出小肠，用生理盐水冲洗肠腔后，每100mg肠组织加入0.5mL PBS(PH7.4)进行匀浆，然后4℃、10000rpm离心40min，吸取上清液-20℃保存待测。肠组织匀浆上清液IL-2的检测采用ELISA法，具体操作按试剂盒说明书进行。

1.7 统计学分析应用SPSS 22.0软件进行数据分析，计量资料以“均数±标准差”表示，多组样本均数的两两比较采用ANOVA分析(方差齐时，采用LSD-t检验，方差不齐时，采用Games-Howell法)，P<0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠一般状态观察正常对照组及生姜煎煮液高、中、低3个剂量组小鼠均活动灵敏，进食正常，仅生姜中剂量组1只小鼠灌胃时误入气管导致死亡，同样条件下补充1只。

2.2 生姜对小鼠肠道菌群的影响EMB琼脂培养基(伊红美兰培养基)、EC琼脂培养基、LBS琼脂培养基和BS琼脂培养基，分别用于大肠杆菌、肠球菌、乳酸杆菌和双歧杆菌的培养。结果发现与正常对照组相比较，生姜煎煮液高、中、低3个剂量组小鼠肠道大肠杆菌和肠球菌数量明显减少，差异具有显著性差异(P<0.05)，生姜煎煮液大剂量组减少最为明显， 3个剂量组的大肠杆菌和肠球菌没有显著差异(P>0.05)。与正常对照组相比较，生姜煎煮液3个剂量组的乳酸杆菌和双歧杆菌的数量均明显增加，具有显著性差异(P<0.05)，大剂量组减少最为明显，3个剂量组之间没有显著性差异(P>0.05)。

表2 生姜对小鼠肠道菌群的调节作用

注：与NC组相比较，*P<0.05

2.3 生姜对小鼠肠道局部免疫功能的影响ELISA法检测发现与正常组小鼠相比较，生姜煎煮液3个剂量组的肠黏膜表面的SIgA和肠组织匀浆上清IL-2的水平都明显提高，差异具有显著性(P<0.05)，生姜煎煮液3个剂量组中高剂量组提高最为明显，3组间无显著性差异(P>0.05)(表3)。

表3 生姜煎煮液对肠粘膜SIgA及肠组织匀浆上清IL-2的影响

注：与NC组相比较，*P<0.05

3 讨论

现代医学研究表明生姜具有抗氧化、降低胆固醇、利胆保肝、消炎镇痛、抗菌防腐、抗肿瘤、健胃止吐、抗血栓等多种作用。生姜中主要的有效成分以姜辣素、姜精油和二苯基庚烷为主[4-5]。生姜发挥其营养、保健、治疗作用的主要靠这些生物活性成分参与机体生化反应体系，调节脂肪氧合酶、细胞色素酶、12-合成酶等关键性酶类的生物合成和代谢，平衡前列腺素、血栓素等体内重要的生物活性物质[6-7]。

生姜还具有抑菌作用，因此常用于食物，尤其是肉类的防腐保存。申晓慧研究发现生姜乙醇提取物对常见的食品污染菌金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌和大肠杆菌都具有良好的抑制作用[8]。张云玲等研究发现，6-姜酚对体外抗幽门螺杆菌的作用很强，标准品6-姜酚的最小抑菌浓度可达到0.02 mg/mL。其机制可能是6-姜酚与Hp 生长所需酶发生了相互作用，抑制了Hp 的生长[9]。

体外实验中发现生姜对多种细菌具有抑制作用，那么，体内应用时对肠道细菌是否是单纯的抑制作用呢？李楚杰等[10]进一步发现，给小鼠消化道给药干姜能增加肠道菌群物种的数量。我们在进行动物体内实验的研究中也发现，每日给小鼠分别灌胃生姜煎煮液1g/mL、0.5g/mL、0.25g/mL 0.25mL(即12.5g/kg、6.25g/kg 和3.125g/kg)，对肠杆菌和肠球菌有抑制作用，而能增加肠道乳酸杆菌和双歧杆菌的数量，与张金辉等人[11]的研究一致。这些研究表明生姜在消化道不是单纯起到抑制细菌的作用，而是对肠道细菌的种群和数量具有调节作用。我们的研究发现生姜能增加益生菌的数量，这可能与生姜的药理作用有关，具体机制还有待进一步研究。

SIgA存在于分泌液中，如唾液、泪液、初乳、鼻和支气管分泌液、胃肠液等。SIgA是机体粘膜局部抗感染免疫的主要抗体[12]。IL-2主要由Th1细胞产生，能够促进B细胞、T细胞分化，活化NK细胞、巨噬细胞，是最重要的细胞因子之一[13]。因此，局部的SIgA和IL-2能很好地代表机体局部组织的免疫功能。熊平源等[14]研究发现生姜能促进脾细胞抗体的生成、增加小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活性及细胞毒活性，增强NK细胞杀伤活性等。刘辉等[15]研究发现生姜醇提物能明显升高脾脏指数，提高荷瘤鼠巨噬细胞吞噬率，升高IgM水平，明显改善荷瘤鼠免疫功能低下的状态。但是生姜对肠道局部免疫功能的研究未见报道。我们通过检测肠道黏膜表面SIgA和小肠组织匀浆上清中IL-2的水平，发现生姜能提高小鼠肠道局部免疫功能。生姜对肠道菌群的调节作用和生姜增强肠道局部免疫功能之间的联系还需要进一步探讨。