壬基酚染毒对大鼠学习记忆能力及脑组织氧化损伤指标的影响

刘雨竹，丛 琳，岑思婷，谢春花，牛莹莹

(1.牡丹江医学院公共卫生学院，黑龙江 牡丹江 157011；2.上海市天平街道社区卫生服务中心，上海 200030)

壬基酚(Nonyl Phenol,NP)是典型的环境内分泌干扰物，重要的化工原料之一，广泛存在于我们的日常生活以及工农业当中，排入环境后很难降解，危害环境，影响健康[1]。近些年来，壬基酚在大多数水体中都可检出，NP 毒性随水溶性的降低而增大，通过食物链蓄积作用进入人体[2]。现已有实验证明[3]：NP可对生殖、泌尿、免疫等系统产生危害，但对神经系统方面的研究很少。本项目研究不同浓度壬基酚染毒对大鼠的学习记忆能力、脑组织脂质过氧化指标的影响，为进一步研究壬基酚对脑组织的损伤作用及机制提供科学实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器设备超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(A001-1)，丙二醛(MDA)试剂盒(A003-1)，过氧化氢酶(CAT)试剂盒(A007-1)，单胺氧化酶(MAO)试剂盒(A034)，均购于南京建成生物工程研究所，壬基酚纯度大于99%(Adamas公司)；电子分析天平(上海精密科学仪器厂)、L500台式低速离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)、紫外-可见分光光度计(日本岛津公司生产，型号UV-2501PC)等。

1.2 实验动物及分组选择健康的SD大鼠，牡丹江医学院动物中心提供，雌雄各半，共32只，体重220～280g。适应性喂养一周，根据体重进行随机分组，分为高、中、低剂量组和空白对照组，每组8只，饲养条件：室温22～24℃、湿度40%～70%，自由进食、饮水。壬基酚用玉米油做溶媒，按照200、100、50mg/(kg·d)的剂量灌胃染毒[4]，对照组给予等量的玉米油，按体重1mL/100g壬基酚灌胃，每日一次，连续灌胃15d。

1.3 学习记忆能力测定采用自制迷宫进行空间探索实验，适度引诱大鼠走出迷宫，训练5min后，记录大鼠独立找到迷宫出口的时间，即为寻找迷宫出口时间[5-6]；将大鼠放置于避暗测试箱内，当其进入暗室即给予针刺，训练5min后测试大鼠从明室第一次进入暗室的时间，即为避暗潜伏时间。

1.4 组织取材及匀浆制备末次染毒后24h后断头处死，快速取大鼠脑组织，生理盐水洗净血污，滤干称重，计算脏器系数，脑脏器系数=脑质量(mg)/体重(g)。称取0.1g脑组织加9倍的生理盐水制成10%的脑组织匀浆，3500r/min，离心15min，取上清液，-20℃冻存备用。

1.5 脂质过氧化指标的测定检测前将待测脑组织匀浆液用考马斯亮蓝标定蛋白浓度，运用羟胺法测定脑组织SOD活力；硫代巴比妥酸(TBA)法测定MDA含量；可见分光光度法测定CAT活性；紫外比色法测定MAO活性；操作严格按试剂盒说明书进行。

1.6 统计学方法运用Excel2007建立数据库，用SPSS 22.0软件进行数据处理，用“均数±标准差”表示，通过单因素方差分析进行组间比较，采用LSD法进行两两比较，P<0.05差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 实验大鼠一般情况空白对照组大鼠精神状态良好，皮毛光滑有光泽，行为敏捷，进食、饮水无异样。壬基酚染毒组出现对外界环境敏感，易激惹，皮毛发黄毛糙等现象。实验前后各组大鼠体质量以及脑脏器系数差异不具有统计学意义(P>0.05)，详见表1。

2.2 壬基酚染毒对大鼠学习记忆能力的影响高剂量组大鼠比空白对照组、低、中剂量组寻找迷宫出口时间延长、避暗潜伏时间缩短，差异具有统计学意义(P<0.05)，详见表2。

表1 壬基酚染毒对大鼠实验前、后体质量

表2 壬基酚染毒对大鼠学习记忆能力的影响

注：与空白对照比较，*P<0.05；与低剂量组比较，#P<0.05；与中剂量组比较，&P<0.05。

2.3 壬基酚染毒对大鼠脑组织生化指标的影响中、高剂量壬基酚染毒组大鼠比空白对照组和低剂量组SOD活力降低、MDA含量升高、CAT活性降低(P<0.05)；低、中、高剂量壬基酚染毒组大鼠比空白对照组MAO活性增强(P值为0.009、0.004、0.000)；高剂量组大鼠比低剂量组SOD活力降低、MDA含量升高、MAO活性增强、CAT活性降低(P<0.05)，详见表3。

表3 壬基酚染毒对大鼠脑组织脂质过氧化指标的影响

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与低剂量组比较，#P<0.05

3 讨论

世界卫生组织全球疾病研究组曾在2010年的报告中提到，环境污染物已经成为影响人类健康并导致死亡的第四位风险因素[7]。2008年欧盟列出13种重要环境污染物，壬基酚便是其中之一。它主要应用于润滑油添加剂，纺织染料、辅助纸、橡胶、石油等行业，通过废水排放到环境当中，可通过食物链进入人体并逐渐蓄积，而造成全身多系统的损伤[8]。根据应锋[9]的实验可知，NP在脑组织存在明显分布，含量可随时间不断增加，滞留时间较长，可通过血脑屏障作用于脑组织。严文霞等人[10]对大鼠接触壬基酚后的神经行为进行检测，发现壬基酚染毒可使大鼠出现焦虑、抑郁行为。毛缜[11]等人通过Morris水迷宫实验发现高剂量 NP 染毒小鼠难以在新环境中适应，学习记忆能力变差。本实验通过迷宫实验和避暗实验对各组大鼠的学习记忆能力进行检测，结果显示：壬基酚高剂量染毒组大鼠比其他组寻找出口时间延长，避暗潜时间缩短，提示200mg/kg·d壬基酚染毒可以影响大鼠的学习记忆能力，可能与NP可以使脑组织损伤，干扰大脑正常功能有关。

目前，脂质过氧化是脑组织损伤重点研究的毒理机制之一。有文献报道中枢神经系统对壬基酚更为敏感，更易受到干扰，导致脑组织脂质过氧化作用增强[11]。MAO等[12]对小鼠进行长达90d的NP染毒，发现NP可降低脑内SOD、CAT，谷胱甘肽过氧化酶和谷胱甘肽还原酶活性，MDA含量升高。从李宏辉等人[13]的实验可知壬基酚染毒后雄性小鼠脑组织可产生脂质过氧化现象，SOD活性降低，MDA含量增多，MAO的活性提高。本实验结果显示，高剂量壬基酚染毒组的大鼠脑组织中的SOD、CAT活性降低、MAO活性升高，MDA含量升高。SOD是生物体内清除自由基的酶，在其作用下，超氧阴离子与氢离子反应生成过氧化氢，可由CAT分解成水[14]。MDA是脂质过氧化的终产物，当体内抗氧化能力减弱时，可大量生成。MAO可以激活神经毒素或提高体内过氧化氢水平对神经产生毒害[15]。高剂量的NP可对脑组织中羟自由基有抑制作用，降低清除自由基的SOD的活性，使氧自由基广泛存在于脑组织中，导致脂质过氧化的终产物MDA的含量升高，NP的毒性作用使脑组织中MAO的活性的提高，CAT活性的降低，促进H2O2生成、积累，最终造成脑组织出现脂质过氧化损伤。

综上所述，高剂量壬基酚染毒可干扰大鼠正常的学习记忆能力，同时可以降低大鼠脑组织中SOD活性、升高MDA含量，增强MAO活性，抑制CAT活性，导致大鼠脑组织出现脂质过氧化损伤；学习记忆能力的影响可能与大鼠脑组织发生脂质过氧化损伤有关，但具体机制需要进一步实验研究探索。