14株伯克霍尔德菌的鉴定分析

王似锦 余萌 胡昌勤 马仕洪

(中国食品药品检定研究院，北京 100050)

洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)最早于1947年由康奈尔大学教授Burkholder分离，分离之初被命名为洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)，由于分子生物学鉴定技术的发展，1992年，该菌被重新分类命名，隶属于伯克霍尔德菌属[1]。目前该菌属共有122个种，通过16S rDNA序列分析，将亲缘关系相近的20余个种划分为一，命名为洋葱伯克霍尔德菌群复合体(Burkholderia cepaciacomplex,BCC)，其中包括基因型Ⅰ(genomovar Ⅰ，代表种为Burkholderia cepacia)、基因型Ⅱ(genomovarⅡ，代表种为Burkholderia multivorans)、基因型Ⅲ(genomovar Ⅲ，代表种为Burkholderia cenocepacia)、基因型Ⅳ(genomovarⅣ，代表种为Burkholderia stabilis)、基因型Ⅴ(genomovar Ⅴ，代表种为Burkholderia vietnamiensis)等，其中洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)是自然界中分离获得的该菌群最常见的菌株之一[2]。

洋葱伯克霍尔德菌在1981年因污染吸入剂导致数名囊性纤维化(CF)患者死亡引起美国食品药品管理局(FDA)的注意，目前该菌已经被FDA明确为不可接受微生物(objectionable microorganism)。近些年来，屡有因为包括药品和卫生用品在内的健康产品污染该菌而召回的案例，FDA也因为该菌的疑似污染，若干次发布警告信息[2-4]。

本研究收集菌种保藏中心以及样品分离的伯克霍尔德菌科，其中包括BCC类群，非BCC的其他伯克霍尔德菌属菌株，也包括已经在2015年被重新分类为类伯克霍尔德菌属菌株，采用4种方法进行鉴定，并对结果进行了比较分析。

1 仪器与材料

1.1 仪器与设备

二级生物安全柜(美国Thermo)，KD-240恒温培养箱(德国BINDER)，显微镜(美国Olympus)，Biolog微生物自动分析系统(美国BIOLOG)、Riboprinter全自动微生物基因指纹鉴定系统(美国DuPont)、PCR仪(美国BIORAD)。

1.2 试剂

Riboprinter细菌鉴定套装(美国DuPont)、BiologGENⅢ细菌鉴定板(美国Biolog)，API 20NE试剂条(法国Bio-Merieux)、细菌基因组DNA提取试剂盒(天根)。

1.3 菌种

来自菌种保藏中心的标株11株，其中非BCC包括：热带伯克霍尔德菌(Burkholderia tropica,CICC10405)、乌拉姆伯克霍尔德菌(Burkolderia unamae,CICC10406)、含羞草结瘤伯克霍尔德菌(Burkholderia nodosa,CICC10407)、抗金属伯克霍尔德菌(Burkholderia matelliresistens,CICC10561)、唐菖蒲伯克霍尔德菌(Burkholderia glaioli,CICC10574)；BCC包括污染伯克霍尔德菌(Burkholderia contaminants,CICC23882)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia,CICC10857)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia,CICC20700)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia,CICC21926)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia,CMCC(B)23001)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkhlderia cepaia，CMCC23002)。样品分离菌3株：20170801、20180108和YY-1。

1.4 培养基

胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA)、胰酪大豆胨液体培养基(TSB)和R2A琼脂培养基(R2A)按照中国药典2015年版四部通则1105非无菌产品微生物限查：微生物计数[5]要求进行配制和灭菌。1/10胰酪大豆胨琼脂培养基(1/10TSA)和1/10胰酪大豆胨液体培养基(1/10TSB)，根据中国药典2015年版[5]的要求和配方，将除了琼脂和水之外的各组分调整为原来的10，琼脂和水的量不变，进行配制和灭菌。

2 方法

2.1 微生物的分离与活化

将菌种保藏中心所得菌种或样品分离菌接种至TSB和1/10TSB培养基中，置于33℃培养24～48h，根据生长情况，分别选取TSB和1/10TSB培养液划线于TSA、1/10TSA和R2A平板上，置于33℃培养24～48h，根据生长情况选取TSA或1/10TSA平板进一步进行鉴定试验。

2.2 鉴定试验

将分离的微生物进行革兰染色，镜检。按照仪器使用操作规程，采用Riboprinter全自动微生物基因指纹鉴定系统和Biolog微生物自动分析系统(使用Biolog GENⅢ细菌鉴定对分离菌进行鉴定。按照试剂条使用说明采用API 20NE试剂条对分离菌进行鉴定，并提交数据库进行比对。采用试剂盒提取细菌基因组，并进行16S rDNA和recA基因序列测定[6]，在NCBI数据库中进行比对分析。16S rDNA序列引物为27f:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG,1492r:TACGGCTACCTTGTTACGACTT；recA序列引物为BCR1:TGACCGCCGAGAAGAGCAA,BCR2:CTCTTCTTCGTCCATCGCCTC。

3 结果与讨论

3.1 14株菌在培养基上的生长情况

有文献报道[7-9]，部分伯克霍尔德菌属的菌更适宜在寡营养培养基中生长，本试验给出了同样的结果。从结果(表1)可以看出，4株菌CICC10405、CICC10406、CICC10407和CICC10561在TSB和TSA培养基中生长缓慢，而在1/10TSB、1/10TSA和R2A培养基中生长良好。其余菌株在5种培养基中生长都较为良好，但总体而言，在1/10TSA和R2A培养基上生长的菌落要大于TSA培养基。

3.2 API20NE鉴定结果

Api20NE适用于非肠道革兰阴性菌，其数据库中伯克霍尔德菌属的菌只包括3个种：B.cepacia、B.gladioli和B.pseudomallei。所以，大部分的标准菌株均鉴定为B.cepacia，另外有2株为无可接受结果。从结果分析可知，Api20NE试剂条只能将伯克霍尔德菌鉴定到属水平。

3.3 Biolog微生物全自动鉴定分析系统鉴定结果

Biolog鉴定系统主要是利用不同碳源进行新陈代谢过程中产生的氧化还原酶与显色物质反应导致的颜色变化(吸光度)以及由于微生物生长造成的浊度差异，还包括细菌对部分化学物质(乳酸、NaCl、抗生素和不同的pH值)的耐受性，通过与标准菌株数据库比较，即可得出鉴定结果。

CICC10574和CICC23882能够准确鉴定到种；几株洋葱伯克霍尔德菌(CICC10857、CICC20700、CICC21926、CMCC(B)23001)均鉴定为Burkholderia pyrrocinia/cepacia，无法确定种，但基本可以确定属于BCC；另外有4株非BCC菌给出了不准确的结果。3株未知菌的鉴定在属水平上正确，且给出的结果也都属于BCC。

3.4 Riboprinter基因指纹图谱鉴定系统

该鉴定系统是利用核糖体DNA在不同菌株中的拷贝数存在差异。限制性内切酶对细菌基因组进行酶切，菌株之间的酶切片段长度、数量存在差异，经特异性探针标记，形成菌株专一的指纹图谱，通过图谱与数据库中的图谱比对，得到鉴定结果。当相似度值S高于0.85时，结果可信，当相似度值S低于于0.85时，结果不可信。

鉴定结果见表2和图1。从结果可以看出，Riboprinter能够准确鉴定到种的有3株，且通过图谱比较可知，其中CICC10857和CICC20700的同源性较高，这与菌种保藏中心给出的溯源信息(这2株菌等同于某一株菌)是一致的。其他几株菌的相似度S均比较低(都低于0.85，甚至只有0.5～0.6)，结果均不可信，但有几株给出了正确的属的信息。20170801-1、20170801-2、20170801-3和20170801-8 4株菌均分离来自同批样品的不同支，虽然鉴定的S值偏低(均低于0.83)，但通过比较条带可知，这4株菌的同源性较高(与20170801-1相比，其他3株菌的相似度达到了0.95以上)。

表1 14株菌在5种培养基上的生长情况Tab.1 Growth conditions of 14 strains in 5 culture mediums

表2 14株伯克霍尔德菌的鉴定结果Tab.2 Identification results of 14 Burkholderia

3.5 16S rDNA和recA序列分析

从16S rDNA序列分析的鉴定结果看，几株洋葱伯克霍尔德菌(B.cepacia)的标准菌株鉴定无法确定到种，只给出了Burkholderia territorii/cepacia的结果，B.cepacia(CICC21926)鉴定为了Burkholderia contaminans。不属于BCC的几株标准菌株均能够正确的鉴定到种水平。其中，CICC10405、CICC10406、CICC10407和CICC10561 4株菌原属于伯克霍尔德菌属，2015年有微生物学家在分析了部分菌的基因特征之后将部分伯克霍尔德菌属的菌划分为新的属，其属名由Burkholderia更改为Paraburkholderia，即类伯克霍尔德菌属，其种名未变[10]。

从recA序列分析结果可知，几株洋葱伯克霍尔德菌(B.cepacia)的标准菌株和2株非BCC的标准菌株(CICC10574和CICC23882)能够准确鉴定到种。4株非BCC的菌未能扩增到目标长度的基因片段，推测由于本实验所用recA引物是根据BCC的recA基因设计，对其他种属特异性不强，这与文献报道一致。

3株未知菌的鉴定，16S rDNA序列无法给出准确的种的结果，但给出的鉴定结果均属于BCC；recA序列分析给出了种的结果：20170801鉴定为B.cepacia，20180108鉴定为B.cenocepacia，YY-1鉴定为B.stabilis。

有文献报道表明，BCC类群中种间的16S rDNA序列相似度极高(98%～100%)，这使被广泛应用于细菌分类学研究和鉴定的16S rDNA序列分析在对BCC进行种水平上的区分时能力有限[11]，很多时候不能鉴定到种水平。对于BCC种间的区分可借助看家基因recA的序列分析来进行[6]。recA基因编码蛋白参与集体DNA重组修复，在细菌基因组中普遍存在，高度保守，其序列分析多应用于遗传关系相近的物种[12-13]。

4 结论

BCC常分离于制药行业和医院的水系统和液体医疗产品中，为条件致病菌，对于免疫力低下的人群有较大的危害性[3,9,14-16]，因此被美国FDA认为是典型的不可接受微生物[3]，应引起制药行业的关注。本研究分别用生理生化(API20NE和Biolog碳源分析系统)、分子生物学技术(核糖体分型、16S rDNA和recA序列分析)的方法对11株标准菌株和3株未知菌进行了鉴定，结果表明：生理生化的方法能够鉴定到属的水平，Biolog能够区分BCC与非BCC类群微生物；16S rDNA序列分析能够鉴定到属水平，对于非BCC的部分菌可以鉴定到种水平，并且能够将BCC正确分类；recA序列分析能够将包含BCC的部分菌正确鉴定到种水平；Riboprinter技术能够鉴定到属水平，但是该技术能够对菌进行同源性比较和溯源分析。在进行该菌的鉴定时，可以参考中国药典2015年版四部9204微生物鉴定技术指导原则的要求，根据自身的需求、技术能力以及能够承担的成本，选择适宜的鉴定方法和技术，依据多相鉴定原则进行鉴定分析，第一步判断是否属于伯克霍尔德菌属；第二步判断是否属于BCC；第三步尽可能准确鉴定到种水平，有必要的情况下进行溯源分析以确认污染来源。

图1 17株伯克霍尔德菌的Riboprinter鉴定结果Fig.1 Results ofidentification and strain typing of 14 Burkholderia by Riboprinter