高效液相色谱法测定茶碱缓释片中无水茶碱含量

刘喜玲，姚 远，周 翔，赵淑敏，李 春，余 龙

（陕西省商洛市药品检验所，陕西 商洛 726000）

茶碱缓释片用于缓解支气管哮喘、喘息型支气管炎、阻塞性肺气肿等喘息症状，也可用于心源性肺水肿引起的哮喘，收载于2015年版《中国药典（二部）》，其含量测定滴定法专属性较差，无水茶碱的含量测定方法多样化［1-9］。本研究中对比不同高效液相色谱（HPLC）法测定茶碱缓释片中茶碱的含量，确定专属HPLC法，操作简便，结果准确、可靠。现报道如下。

1 仪器与试药

仪器：1260型高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）；UV-2600型紫外分光光度计（日本岛津公司）；BT125D型电子分析天平（赛多利斯科学仪器公司）；AS7240A型超声溶解仪（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；1HP-10-H型试验用超纯水机（重庆力德高端水处理设备研发有限公司）。

试药：氨茶碱缓释片（广州迈特兴华制药有限公司，批号为 20170822，规格为 0.1 g）；氨茶碱缓释片（惠州大亚制药股份有限公司，批号为170901，规格为0.1g）；氨茶碱缓释片（广州白云山光华制药股份有限公司，批号为 T70021，规格为 0.1 g）；茶碱对照品（中国食品药品检定研究院，批号为100121-201104，含量为100%）。甲醇（色谱纯，Sigma-aldrich 公司）；乙腈（色谱纯，Sigma-aldrich公司）；醋酸钠（分析纯，天津市河东区红岩试剂厂）；磷酸二氢钾（分析纯，天津市北辰方正试剂厂）；三乙胺（分析纯，天津市北辰方正试剂厂）；戊烷磺酸钠（分析纯，天津市科密欧学试剂厂）；冰乙酸（分析纯，天津市大茂试剂厂）；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

称取茶碱对照品25.17 mg，精密称定，置100 mL容量瓶，加流动相 30mL，热水浴超声使溶解［9-12］，放冷后，用流动相稀释至刻度，摇匀，得质量浓度为0.251 7 g／L的对照品贮备液。精密量取10 mL，置25 mL容量瓶，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。分别取茶碱缓释片20片，精密称定，研细，精密称取细粉适量（约相当于无水茶碱0.1 g），置100 mL容量瓶中，加流动相30 mL，热水浴超声使溶解，放冷，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 mL，置50 mL容量瓶，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.2 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18柱（150 mm ×4.6 mm，4 μm）；流动相：0.12% 戊烷磺酸钠［用冰醋酸调节 pH 至（2.9 ±0.1）］-甲醇（80∶20，V/V）；检测波长：272 nm；进样量：10 μL；柱温：35 ℃；流速：1 mL ／min。在此色谱条件下，对应的理论板数最高为10 890，符合理论板数大于5 000的要求（参考茶碱缓释胶囊色谱条件），拖尾因子为 1.089 37，色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图

2.3 方法学考察

线性关系考察：分别精密量取2.1项下茶碱对照贮备液 1，2，3，4，5，6，8，10 mL，置 10 mL 容量瓶，以进样质量浓度（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程Y＝40 355X-22.003，R2＝0.999 6（n＝8）。结果表明，茶碱进样质量浓度在 25.2～252μg／mL范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密量取茶碱对照品溶液10 μL，在拟订色谱条件下，重复进样6次。结果平均峰面积为4352.45，RSD为0.10%（n＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取样品（批号为20170822）适量，依法制备供试品溶液供试品溶液，按拟订色谱条件，分别于0，2，4，8，12，24 h 时进样测定茶碱的峰面积。结果的RSD为0.33%（n＝6），表明供试品溶液在24h内稳定。

重复性试验：精密称取样品（批号为20180822）6份，按2.1项下的方法制备供试品溶液，进样10 μL测定峰面积。结果茶碱平均含量为99.20 mg，RSD为0.21%（n＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：精密称取样品（批号为20170822）共9份，分别置10 mL容量瓶，精密称取茶碱对照品9份，分别加入上述9份样品中，用流动相稀释至刻度，摇匀，按拟订色谱条件测定，计算样品含量。结果见表1。

表1 茶碱加样回收试验结果（n＝9）

2.4 样品含量测定

取3批样品，按2.1项下方法平行制备2份供试品溶液，在拟订色谱条件下分别进样2次，每次10 μL，测定峰面积，计算含量。结果3批样品（批号分别为20170822，170901，T70021）平均含量分别为 99.03% ，99.63% ，94.27%，RSD分别为 0.34%，0.31%，0.14% （n＝4）。

3 讨论

流动相选择：分别以4种不同流动相比例，即甲醇-水（30 ∶70）、甲醇 -0.05 mol／L 的磷酸二氢钾 -三乙胺（25 ∶75 ∶0.2）、醋酸盐缓冲液（取醋酸钠 1.36 g，加水100 mL使溶解，加冰醋酸5 mL，再加水稀释至1 000 mL，摇匀）-乙腈（97 ∶7）、0.12%戊烷磺酸钠［用冰醋酸调节 pH 至（2.9±0.1）］-甲醇（80 ∶20，V/V）进行试验，与其他3种方法相比，最后一种流动相对应的理论板数高，拖尾因子小，峰形对称，分离度符合要求，故选用其作为流动相。

检测波长选择：采用紫外-可见分光光度法，将茶碱对照品溶液在200～300 nm波长范围内进行扫描，λmax为 272 nm，确定 272 nm 作为检测波长［10-11］。

溶剂选择：分别用4种流动相溶解同一批样品，使用同一检验方法进行测定，其中使用甲醇-水（30∶70，V/V）作为溶剂进行溶解的样品，主峰面积最大，杂质峰总面积最小，甲醇-水（30∶70，V/V）与茶碱互溶性最好，辅料干扰较小，选择性最强，故采用甲醇-水（30∶70，V/V）作为溶剂［7］。

样品前处理方法选择：考察水浴温度和超声时间前处理方法对样品溶解的影响，结果显示，水浴温度60℃、超声10 min，测得茶碱含量最高，较低的水浴温度不利于茶碱的释放，随着水浴温度的增加和超声时间的延长，茶碱含量基本稳定，但杂质含量显著增高，故适当降低水浴温度和超声时间，并选择合适的水浴温度和超声时间，可有效促进茶碱的溶出，避免长时间高温水浴导致待测物质分解［12-15］。