柴胡安心胶囊平行四波长高效液相色谱指纹图谱研究*

于 静，焦丽亚，张振杰，王玲娇△，杨继章，孙国祥 ，周春华

（1.河北医科大学第一医院，河北 石家庄 050031；2.沈阳药科大学药学院，辽宁 沈阳 110016）

柴胡安心胶囊为河北医科大学第一医院的医院制剂（批准文号：冀药制字Z20060013），由柴胡、葛根、白芍、桂枝、夏枯草等14味药材组方，具有疏肝理气、镇静安神、调和营卫之功效，主治焦虑抑郁和心脏神经官能症［1］。有报道采用高效液相色谱（HPLC）法测定处方中单味药材代表成分和建立单味药材的指纹图谱［2-4］，柴胡安心胶囊（CHANCs）的质量标准目前只有显微鉴别和薄层鉴别［5］，尚未见关于其指纹图谱研究方面的报道。单波长指纹图谱鉴定的中药质量具有随机性和偶然性，多波长指纹图谱可充分反映复方制剂在不同特征波长下的多维信息，更加准确地区分具有多个化学成分的复方制剂的质量等级［6-8］。本研究中建立了CHANCs的平行四波长指纹图谱，采用系统指纹定量法鉴定其整体质量，为其质量标准的建立提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

1200 Series型高效液相色谱仪（美国Agilent科技有限公司）；Sartorius BS 110S型电子分析天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；KQ-400KDE型高功率数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；微孔滤膜（0.45 μm，上海兴亚净化材料厂）。

1.2 试药

没食子酸对照品（批号为17062510），大豆苷对照品（批号为 17060913），肉桂酸对照品（批号为20171102），葛根素对照品（批号为 17072302），绿原酸对照品（批号为17081021），规格均为每瓶20 mg，均购于上海士锋生物科技有限公司；芦丁对照品（批号为20130809），槲皮素对照品（批号为 20121205），规格均为每瓶20mg，均购于美仑生物科技有限公司；柴胡安心胶囊（规格为每粒 0.5 g，批号分别为 150601，150518，150419，150407，080115，080302，080403，20180725，编号分别为S1～S8，河北医科大学第一医院）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：DiamonsilC18柱（250mm ×4.6mm，5μm）；流动相：0.5% 乙酸水（A）- 甲醇（B），梯度洗脱，0～40 min时5% ～25%B，40～60 min时25% ～60%B，60～80 min时 100%B；检测波长：254，275，290，330 nm；流速：1 mL ／min；进样量：10 μL；柱温：30 ℃。

样品（批号为S2）制备供试品溶液并取混合对照品溶液，按拟订色谱条件分别进样，记录275 nm波长下的色谱图，详见图1。葛根素峰与相邻峰分离较好，峰面积较大，理论板数不低于300 000，故选其作为参照峰。2 h空白溶液和供试品溶液色谱图表明，检测系统无其他峰干扰，组分在80 min内出峰完全。

图1 高效液相色谱图

2.2 溶液制备

称取葛根素对照品30 mg，精密称定，置10 mL容量瓶，用甲醇定容至刻度，摇匀，得对照品溶液。分别称取大豆苷、没食子酸、绿原酸、肉桂酸、芦丁、槲皮素对照品（17，7，21，12，21，18 mg），用甲醇定容于 25 mL 容量瓶中，作为对照品贮备液。

称取同一批样品（批号为S2）内容物0.5 g，精密称定，加入约50 mL 50%乙醇回流1.5 h，过滤，残渣中加入50 mL 50%乙醇继续回流1.5 h，重复2次，合并3次滤液，减压浓缩至约15 mL，加50%乙醇定容至25 mL，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.3 指纹图谱检测波长确定

处方中的柴胡药效成分柴胡皂苷类吸收波长约在230 nm，白芍的芍药苷最大吸收波长约为254 nm，葛根活性成分葛根素的最大吸收波长为280 nm，夏枯草有效成分迷迭香酸的最大吸收波长约为320 nm［9-12］。为使该复方制剂中的主要化学成分均能显现最大紫外吸光度，尽可能地反映组方中代表成分的综合特点，本研究中利用DAD检测器扫描190～400 nm波长信号，依据具有药效作用的药材化学成分的紫外吸收光谱特征，最终选取了 4 个特征波长（254，275，290，330 nm）。

2.4 方法学考察

精密度试验：精密吸取供试品溶液［取样品（批号为S2）依法制备］10 μL，连续进样 6 次，分别记录 4 个检测波长下的色谱图。结果以葛根素峰的保留时间和峰面积为参照，四波长各指纹峰相对保留时间的RSD均小于1.00%，相对峰面积的RSD均小于 3.03% （n＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：精密吸取供试品溶液［取样品（批号为S2）依法制备］分别于 0，4，8，12，24 h 时进样测定，记录4个检测波长下的色谱图。结果以葛根素峰的保留时间和峰面积为参照，四波长各指纹峰相对保留时间的RSD均小于 1.00%，相对峰面积的RSD均小于3.00%（n＝6），表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

重复性试验：取样品（批号为S2），平行制备供试品溶液6份，精密吸取10 μL进样测定，分别记录4个检测波长下的色谱图。结果以葛根素峰的保留时间和峰面积为参照，四波长各指纹峰相对保留时间的RSD均小于1.00%，相对峰面积的RSD均小于2.94% （n＝6），表明方法重复性良好。

2.5 CHANCs四波长指纹图谱分析

平行四波长指纹图谱的建立：将8个批次样品的供试品溶液分别进样测定，记录色谱图。以葛根素峰为参照物峰，按峰出现率100.00% 计，确定各检测波长下的共有指纹峰，分别是 63 个（254 nm）、65 个（275 nm）、53个（290 nm）、27个（330 nm）。将 8批样品指纹图谱信号导入“中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统4.0”软件，按平均值法生成对照指纹图谱（RFP），对照指纹图谱和各个批次样品HPLC指纹图谱见图2。

系统定量法综合评价CHANCs平行四波长指纹图谱质量：以生成的各个波长的对照指纹图谱为标准，依次计算8批样品的宏定性相似度（Sm）、宏定量相似度（Pm）、指纹均化性变异系数（α），详见表 1。用均值法整合平行四波长HPLC指纹图谱，计算Sm，Pm，α，用6级系统指纹定量法评价的质量结果见表2。结果显示，8个批次样品的Sm值均大于0.95，但 α值均小于0.15，在一定程度上表明不同批次样品的平行指纹图谱在化学成分数量和分布比例上有一定差异；Pm值除S1，S3，S7外，其余批次样品均大于95%，表明不同批次样品的宏定量相似度无显著差异。最终评价的质量等级为S7为Ⅲ级，S1和S3为Ⅱ级，其余批次均为Ⅰ级。通常规定质量等级为Ⅴ级及以上时说明样品质量合格，因此本研究中测定的8 批CHANCs 样品均为合格品。

图2 四波长下8批柴胡安心胶囊的高效液相色谱指纹图谱和其对照指纹图谱

表1 系统指纹定量法评价柴胡安心胶囊质量结果

表2 柴胡安心胶囊平行指纹图谱与各波长指纹图谱结果

四波长下CHANCs的质量评价结果比较：将不同批次的样品各个波长下分别建立对照指纹图谱，采用系统指纹定量法评价其质量。结果见表3。可见，各样品Sm和α相对偏差差异较小，表明指纹信号相似度、均化性与对照指纹图谱差异较小。单波长的质量级别的划分主要由Pm决定。不同评价方法的Pm值比较结果见图3。4个特征波长和平行谱的质量等级比较结果见图4，可见，同一样品在不同波长下评价结果提示了个别批次样品的质量差异很大，均值法整合的平行谱的质量等级和254 nm和330 nm波长下的质量等级结果相近，却又有所不同，平行谱综合了单个波长评价CHANCs质量的不足，使评价结果更接近真实结果。

图4 不同评价方法得到的样品质量等级比较

3 讨论

3.1 色谱条件选择

柴胡安心胶囊主要药材的成分如没食子酸、大豆苷、肉桂酸等极性差异较大，故首选梯度洗脱。试验过程中，发现色谱图中4个主成分大峰难以分开，多次更换流动相比例和色谱柱均达不到基线分离，最后通过逐一单位药材按供试品溶液方法处理进样比对已知葛根中相关成分极性相差较小导致。故参考《中国药典》的方法，选择5% ～25%甲醇在40 min内缓慢升高梯度，使其相关峰得到分离。选择流动相时，发现没食子酸和大豆苷的色谱图拖尾严重，选择了不同体积分数的醋酸溶液，发现随着醋酸比例的升高，上述成分的峰形逐渐对称，进而达到测定要求。

3.2 平行指纹图谱技术的均值法评价

利用任意的单个波长均不能完整地表达制剂中不同种类化学成分的全部指纹信息，因此选择单味药材中具有药效作用的主要成分下的特征波长，对不同波长下色谱图进一步整合，得到复方制剂的多维信息，才能最终鉴别其真实质量。本试验中分别采用独立权重法、均值法和投影参数法、信息熵权重法［13-14］整合各批次样品在4个特征波长下的定性、定量指纹图谱信息，以系统指纹定量法评价质量，发现8个批次的样品质量等级基本一致。结合均值法简单便捷的特点，最终选择其作为整合指纹整体信息的方法。