急性丙型肝炎患者血清IFN-λ3与HCV RNA水平之间的关系*

张 丽 姜树勤 吴彩花 周红霞 王建华

1.邯郸市传染病医院感染科 (河北 邯郸， 056002) 2.邯郸市传染病医院重症肝病科 3.河北工程大学附属医院消化内科

丙型肝炎病毒(HCV)感染是导致肝炎、肝硬化、肝癌发生的主要原因之一。急性HCV感染通常无明显症状，60%～80%的急性HCV感染者可发展为慢性丙型肝炎(CHC)，而其中30%CHC患者可进展为肝硬化、肝癌，且肝细胞癌的发生率是正常人的20～30倍[1]。干扰素(IFN)-λs是机体细胞受到病毒感染刺激后所分泌的一类具有抗病毒、免疫调节等多种生物活性的特异性细胞因子。HCV感染后可直接产生IFN-λs并抑制HCV的复制，IFN-λ3是IFN-λs的III型亚型。全基因组关联研究表明，编码IFN-λ3的IFNL3(IL28B)基因附近区域的单核苷酸多态性(SNPs)与AHC中HCV RNA的缺失相关，能够影响HCV治疗的反应性[2]。本研究调查了AHC患者HCV感染后血清IFN-λ3水平与HCV RNA含量的变化及其相关性，并初步分析IFNL3 rs8099917基因多态性对血清IFN-λ3水平与HCV RNA含量的影响，为进一步揭示AHC疾病的发生机制提供参考。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾性分析邯郸市传染病医院收治的159例AHC患者(急性感染组)的临床资料，患者症状出现后10天内至邯郸市传染病医院就诊。其中男87例，女72例，年龄8～80岁，平均(43.11±10.34)岁。另选择同期于邯郸市传染病医院体检的健康者100例作为对照组，医学体检和临床病史调查均无肝脏疾病史，年龄8～80岁，平均(42.09±11.32)岁，其中男56例，女44例。本研究经邯郸市传染病医院伦理委员会批准。所有受试者均知情同意。

1.2 纳入与排除标准 纳入标准：①根据Grebely等人提出的诊断标准[3]，血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平≥400U/L，HCV RNA阳性且抗HCV抗体阴性或抗HCV抗体阳性在低临界指数(<10)；②患者HCV感染不超过10天；③无近期自然HCV感染史和治疗史；④患者同意接受相应HCV治疗；⑤所有患者乙型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒均为阴性。排除标准：①伴因感染性、毒性或自身免疫性疾病而导致的其他肝病；②有明确的急性丙肝病史，未经任何治疗痊愈者；③经干扰素及利巴韦林抗病毒治疗；④HCV感染或发病日期不明；⑤妊娠或哺乳期妇女。

1.3 临床资料及标本采集 收集所有受试者临床医学体检和其他生化及影像学检查资料，包括血常规、肝功能、甲状腺功能三项、自身免疫性抗体等。采集受试者入院行体格检查时静脉血5ml，置于4℃待测。

1.3 观察指标及检测方法

1.3.1 血清IFN-λ3水平检测 入院时收集对照组与急性感染患者3ml EDTA抗凝血，4℃ 3000r/min离心5min后，采用人血清IFN-λ3 酶联免疫吸附试剂盒(上海哈灵生物科技有限公司)检测血清IFN-λ3水平，所有操作均严格按照制造商说明书进行。

1.3.2 IFNL3 SNP基因分型 采用全血基因组DNA提取试剂盒(美国Sigma-Aldrich)提取基因组DNA，使用分光光度计测量提取DNA浓度，取260/280波长比为1.7～2.0之间的DNA用于后续实验。通过焦磷酸测序仪检测IFNL3 SNP位点(rs8099917)。

1.3.3 HCV RNA病毒定量分析 收集研究对象1.2ml EDTA抗凝血，4℃ 3000r/min离心5min后，采用全自动荧光定量PCR仪以及配套试剂进行HCV病毒定量检测。

2 结果

2.1 急性感染组患者和对照组人员基线资料比较 见表1。

表1 基线资料在两组人员间的差异

2.2 受试者基线血清IFN-λ3水平与HCV RNA载量比较 见表2。

表2 AHC患者与对照组基线血清IFN-λ3水平比较

与对照组相比，*P<0.05

2.3 AHC患者基线血清IFN-λ3水平与HCV RNA的关系 AHC患者基线血清IFN-λ3水平与基线HCV RNA载量呈明显正相关(P<0.05)，见图1。

图1 AHC患者血清IFN-λ3水平与基线HCV RNA载量的相关性散点图

2.4 IFNL3 SNP对AHC患者基线血清IFN-λ3水平和HCV RNA载量的影响 见表3。

表3 IFNL3 rs8099917对AHC患者基线血清IFN-λ3水平和HCV RNA载量的影响

2.5 HCV感染后影响HCV RNA载量的危险因素分析 经Logistic多因素回归分析发现，rs8099917基因型、IFN-λ3均是HCV RNA载量的危险因素(P<0.05)，见表4。

表4 影响HCV RNA载量的多因素分析

3 讨论

丙型肝炎作为一种全身性传染病，能够对肝脏产生持续性损伤。丙型肝炎的发生机制在于HCV感染后，引起病毒血症，同时其复制能够干扰细胞内大分子的合成，导致溶酶体膜通透性发生改变，最终引起细胞病变。急性HCV感染通常无明显症状，少数患者会发生自发性清除，但60%～80%的HCV感染是持续性的，可发展为CHC，而其中30%CHC患者可进展为肝硬化和肝癌。临床研究证实，25%以上的急性丙型肝炎患者一般在6个月内能够自发清除病毒[4]；此外，针对急性HCV感染的治疗能够增强病毒的清除[5]。了解自发性或治疗诱导的HCV清除的相关因素，将改善与AHC早期干预治疗有关的临床决策。研究证实，人类白细胞抗原、炎症趋化因子、白细胞介素、干扰素基因等均与HCV感染有关，且这些遗传基因变异可能影响机体免疫功能，从而影响HCV感染的不同临床结局[6]。

IFN-λ3作为III型干扰素，是由IFNL3基因编码的抗病毒相关细胞因子，属于IFN-λ家族成员之一。IFN-λ主要是在树突状细胞(DCs)对病毒蛋白产生应答反应时产生，能够通过激活JAK-STAT信号途径，诱导STAT1和STAT2磷酸化，并诱导干扰素刺激基因3(ISGF3)复合物产生，进而促进2′,5′-寡腺苷酸合成酶基因家族和MxA蛋白表达，从而发挥抗病毒效应[7]。肝细胞、 2型髓系树突状细胞(mDCs2)和浆细胞样树突状细胞(pDCs)均能够产生响应于HCV的IFN-λ。在原代人肝细胞HCV暴露实验中发现，HCV能够诱导IFN-λ3产生[8]。另外，当人mDCs2和pDCs暴露于HCV刺激时，不仅能够产生大量IFN-λ3，而且能够释放少量IFN-α和IFN-β[9]。小鼠模型中发现，HCV感染能够诱导肝脏中IFN-λs基因表达。研究证实，IFN-λ3诱导ISGFs作为先天性免疫反应中的第一道防线，在抗HCV病毒应答反应中起非常重要的作用[10]；此外，IFN-λ3能够抑制HCV复制，并有效防止HCV扩散[11]。本研究发现，HCV感染能够刺激机体产生IFN-λ3，IFN-λ3在病毒感染的肝细胞中表达，同时起到特异性抗病毒作用，其表达水平越高，对HCV的抑制作用越强。

编码IFN-λ3的IFNL3(IL28B)基因位于19号染色体上，包含6个外显子。全基因组关联研究发现，IFNL3基因自身及上游的2个SNPs，rs8099917和rs12979860(有利的等位基因分别为TT和CC)参与影响基于IFN的HCV感染治疗疗效[12]。Yu等人研究发现，IFNL3 rs8099917等位基因T的HD受试者自发性HCV清除率较高[13]。研究表明，IFN-λ3表达水平和功能的变化可能是由IFNL3 SNP所决定[14]。Thomas发现，SNP rs12979860与干扰素治疗应答相关性最强，携带CC基因型的个体对治疗产生应答的持续病毒学应答(SVR)率是携带TT基因型个体的2倍[15]。Suppiah等人发现，SNP rs8099917与HCV治疗应答相关，携带TT和TG基因型个体的HCV治疗应答失败危险性显著低于携带GG基因型个体[16]。其中，SNP rs8099917位于IFNL3基因本身上游启动子区8.9db，而SNP rs12979860位于IFNL4基因的内含子1内[17]。故本研究主要以 rs8099917作为标签SNP进行分析。研究证实，SNP rs8099917能够从转录水平上影响IFNL3表达，进而影响INF-3的表达和功能[18]。Tanaka[19]和Suppiah等人的研究均发现，携带INFL3 rs8099917 TT保护性基因型的人群中，血清IFN-λ3 mRNA表达显著高于携带G危险等位基因的人群。这表明，IFNL3基因多态性能够影响IFN-λ3的表达。本研究发现，rs8099917 TT保护性基因型能够促进IFN-λ3表达并参与AHC疾病发生过程。

研究发现，rs12979860 C等位基因与较高的基线HCV RNA载量有关，且这种相关性只发生在高病毒裁量的患者中，而在低HCV RNA载量组呈负相关[20]。Ikezaki等人也发现，rs12979860 CC基因型与较高的基线病毒载量有关[21]。而Rauch等人发现，IFNL3基因变异与基线HCV RNA载量无关[22]。rs8099917位点突变与AHC患者基线HCV RNA载量的关系尚不清楚。本研究发现，携带IFNL3有利等位基因能够促进IFN-λ3的表达，增强细胞因子对ISGFs的诱导作用，使ISGFs表达水平上升，从而增强AHC患者HCV感染后的抗病毒应答能力。同时本研究发现，rs8099917基因型、IFN-λ3均是HCV RNA含量的危险因素，血清IFN-λ3与AHC患者HCV RNA水平密切相关，并可促进疾病发生、发展。

综上所述，急性丙型肝炎患者基线血清IFN-λ3水平的升高与血清HCV RNA载量呈正相关，IFNL3基因多态性能够影响急性HCV感染患者基线IFN-λ3水平。本研究仅讨论rs8099917对IFN-λ3表达水平的影响，而对IFN-λ3功能影响的研究还需更深入探究。另外，本研究样本量较少，后续研究中应扩大样本量，以期为IFN-λ3与抗HCV病毒的相关机制提供更充分的实验依据。