基于网络药理学的荜茇降血脂作用机制研究*

蔡淑珍，李建良，陈圆，萨如拉，李志勇，图雅

(1.内蒙古民族大学蒙医药学院，通辽 028000；2.中国中医科学院医学实验中心，北京 100700；3.山西中医药大学中药学院，晋中 030600；4.中央民族大学药学院，北京 100081；5.中国中医科学院中医药发展研究中心，北京 100700)

随着生活水平的提高和饮食结构、生活习惯变化，由高脂血症引发的动脉粥样硬化、心肌梗死、冠心病等心脑血管疾病发生率迅速升高，且有年轻化的趋势，因此人们不得不开始重视高脂血症引起的健康问题[1]。蒙医药作为我国四大少数民族医药之一，是蒙古族人民长期与疾病作斗争的经验总结。蒙药因丰富的药材资源，较少的不良反应，在预防和治疗高脂血症及其引发的各类心血管疾病中有着明确疗效[2]。

荜茇为胡椒科植物荜茇(PiperlongumL.)的未成熟或成熟果穗，蒙药名为“荜荜灵”，味辛、性温，效腻、锐、轻、燥，具有调理胃火，祛“巴达干”“赫依”，调元，滋补强壮，平喘，祛痰，止痛等功效[3]；蒙医临床常用于治疗胃火衰败、不思饮食、消化不良等寒性疾病。荜茇作为蒙医习用药材，在蒙药临床方剂中应用较广泛，约有195个临床常用方剂中含有荜茇[4-5]。现代研究表明，荜茇具有调血脂、抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗氧化、保护胃黏膜等药理作用[6-8]。

近年来，网络药理学提出并用于从系统生物学角度研究并阐释中药药效物质基础及作用机制，为民族药的现代研究提供了示范和启迪。对于民族药的现代研究，应着力于阐释其物质基础，阐明其作用机制，并将承载于民族药上的民族医药理论和经验特征讲清楚[9-12]。因此，从传统蒙医理论和临床经验出发，运用网络药理学方法阐明荜茇祛“巴达干”“赫依”，及 “分清别浊”功能，进一步揭示其降血脂、干预高脂血症的药效机制，可为后续研究提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1材料 中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP，http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)；PharmMapper Server数据库(http：//lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/index.php)；Uniprot数据库(http：//www.uniprot.org/)；人类孟德尔遗传数据库(OMIM)(http：//www.omim.org/)；DiGSeE(http：//210.107.182.61/geneSearch);Genecards(http：//www.genecards.org/);京都基因与基因组百科全书(KEGG，https：//www.kegg.jp/);Metascape(http：metascape.org/gp/index.html)。

1.2荜茇候选成分的筛选 通过TCMSP数据库查询获得了104种化学成分，按口服生物利用度(oral bioavailability，OB≥30%)和类药性(drug-likeness ，DL≥0.18)筛选出15种符合条件的化合物，将其作为候选化合物，结果见表1。

1.3潜在靶点预测与查询 根据所获得的有效成分，从PharmMapper Server 数据库获取Fit Score ≥3.0的靶点，并从Uniprot数据库获得靶蛋白相关信息，该数据库包含全面的蛋白质信息，包括蛋白质名称以及对应的标准基因名称，可用于蛋白名(protein ID)和基因名(gene ID)的转化。

1.4药物对应疾病信息查询 采用OMIM数据库、DiGSeE文本挖掘、Genecards以“Hyperlipidemia”为关键词进行检索，获取靶蛋白进行筛选，得到候选药物治疗高脂血症的相关靶蛋白，将药物靶点与疾病靶点通过Tbtools取交集。

1.5基因本体(GO)富集分析与通路注释 将预测得到的靶点利用Tbtools取交集，之后将得到的靶标蛋白导入到WebGestalt数据库，进行GO功能注释，再结合Metascape进行KEGG通路分析，通过查阅文献和KEGG数据库得到与荜茇治疗高脂血症相关的通路。

1.6药物-靶点-作用通路的网络构建 根据候选药物、相关靶点及通路信息，采用Cystoscope 3.2.1进行网络构建、分析和可视化。运用Cytoscape软件的Merge插件建立荜茇有效成分治疗高脂血症的“候选药物-靶点-作用通路”网络图。

2 结果

2.1候选化合物预测潜在靶点相关信息 通过TCMSP数据库结合文献查询，获得104种化学成分，并通过OB≥30%和DL≥0.18两个关键参数，筛选出荜茇中15种具有良好OB和DL性的化合物，见表1。

利用OMIM数据库、DiGSeE文本挖掘、Genecards查询候选药物治疗高脂血症的相关靶蛋白信息，将药物靶点与疾病靶点通过Tbtools取交集，得到与高脂血症相关的31个靶点，相关信息见表2。

结合表1和表2信息，荜茇有效成分既可作用于相同靶点也可作用于不同的靶点，说明蒙药多成分、多靶点、协同增效的作用机制。

2.2GO富集分析与通路注释 运用WebGestalt数据库进行GO功能注释和Pathway通路分析。GO功能注释是通过生物过程(biological processes，BP)、分子功能(molecular function，MF)和细胞组分(cell components，CC)对基因进行注释和分类。GO功能注释见图1，在分子功能中蛋白结合、分子作用、分子传感器活性影响相对靠前，在生物过程中代谢过程、生物调节、多细胞生物所占比例高，在细胞组分中细胞膜、囊泡、细胞核相关性最大。为进一步明确核心关键靶标的生物学功能，通过Metascape数据库对关键核心靶点进行通路富集分析,选取差异有统计学意义(P<0.05) 的所有通路,得到22条间接或直接与高脂血症相关的通路，见表3。其中与脂质代谢相关的通路：磷酸腺苷依赖的蛋白激酶(AMPK)、调节脂肪细胞中的脂肪分解(regulation of lipolysis in adipocytes)、过氧化物酶体增殖剂激活受体(PPAR signaling pathway,PPARs)；血小板相关的通路：血小板激活(platelet activation)；信号转导相关的通路：钙信号通路(calcium signaling pathway)、cGMP-PKG信号通路(cGMP-PKG signaling pathway)、cAMP信号通路(cAMP signaling pathway)、HIF-1信号通路(HIF-1 signaling pathway)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)；心血管病相关的通路：心肌细胞肾上腺素能信号传导 (adrenergic signaling in cardiomyocytes)；信号分子相互作用有关的通路：神经活性配体-受体相互作用(neuroactive ligand-receptor interaction)、神经递质相关5-羟色胺能突触(werotonergic synapse)；内分泌相关的通路：胰岛素抵抗(insulin resistance)；炎症相关的通路：白细胞介素17(interleukin 17，IL-17)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)、Toll样受体(Toll-like receptors，TLR)、NOD样受体(NOD-like receptor，NLR)、瞬时受体电位通道(transient receptor potential channel,TRP)的炎症递质调节；糖尿病相关的通路：糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)；自身免疫相关的通路：Th17细胞分化(th17 cell differentiation)；动脉粥样硬化相关的通路：流体剪切应力和动脉粥样硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)；肝病相关的通路：非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)。

表1 荜茇候选成分

表2 荜茇抗高脂血症的相关靶点

A.分子功能分析；B.生物过程分析；C.细胞组分分析。

表3 荜茇抗高脂血症相关靶点的KEGG 通路富集分析

Tab.3EnrichmentanalysisforKEGGpathwaysofthetargetsofPiperlongumL.againsthyperlipidemia

通路通路ID靶点频次AMPK信号通路has04152ACACA,CCNA2, PPARG3钙信号通路has04020ADRB1,ADRB2,5 HTR2A,NOS2,NOS3脂肪细胞的脂解调节has04923ADRB1,ADRB2,4 PTGS1,PTGS2神经活性配体-受体相互作has04080ADRB1,ADRB2,F2,5 用 HTR2A,PRSS1心肌细胞中的肾上腺素能信has04261ADRB1,ADRB2,4 号转导 MAPK14,SCN5AcGMP-PKG信号通路has04022ADRB1,ADRB2,NOS33cAMP信号通路has04024ACOX1,ADRB1,3 ADRB25-羟色胺能突触has04726HTR2A,PTGS1,4 PTGS2,SLC6A4HIF-1信号通路has04066IL-6,NOS2,NOS33胰岛素抵抗has04931IL-6,NOS3,PTPN13VEGF信号通路has04370MAPK14,NOS3,PTGS23IL-17信号通路has04657MAPK14,IL-1B,IL-6,4 PTGS2AGE-RAGE信号通路在糖has04933MAPK14,IL-1B,IL-6,4 尿病并发症中的作用 NOS3Th17细胞分化has04659MAPK14,IL-1B,IL-6,4 RXRATNF信号通路has04668MAPK14,IL-1B,IL-6,4 PTGS2Toll样受体信号通路has04620MAPK14,IL-1B,IL-63流体剪应力与动脉粥样硬化has05418MAPK14,IL-1B,NOS33非酒精性脂肪性肝病has04932IL-1B,IL-6,RXRA3 (NAFLD)NOD样受体信号通路has04621MAPK14,IL-1B,IL-63TRP通道的炎症递质调节has04750MAPK14,HTR2A,IL-1B3PPAR信号通路has03320ACOX1,PPARG,RXRA3血小板活化has04611MAPK14,NOS3,PTGS13

2.3药物-靶点-作用通路相互作用的网络构建 采用Cytoscape软件构建荜茇治疗高脂血症的“有效成分-靶点-作用通路”网络，见图2，以不同颜色节点(node)分别表示活性成分、潜在作用靶点及作用通路，边(edge)代表活性成分、潜在靶点及作用通路之间的相互关系，图2可见荜茇15个有效成分直接或间接作用于31个靶点，由此可知荜茇多成分、多靶点、多通路治疗高脂血症的特点。其中主要通过干预AMPK、PPAR等主要通路来达到降脂作用。

3 讨论

蒙医学以 “三根学说”为理论基础，即“赫依”“希拉”“巴达干”三大元素在保持相对平衡时，机体处于健康稳定状态。若因节气、起居、饮食、行为、情志和外伤等外缘使“三根”“七素”和“三种秽物”协调被打乱，就会产生疾病[13]。传统蒙医认为，当饮食及外界因素之油腻及湿重成分过甚，导致胃之分清食物精浊的功能失调，肝分清血之清浊功能亦随之失调，清浊未分离，导致血中“清浊”失调[14]。现代医学指出，高脂血症是由于外源性脂质或其他物质摄取增加，内源性脂质合成增加，以及脂质转运或分解代谢异常。蒙医与西医关于高脂血症的成因观点类似[15]。蒙医认为，荜茇能够调理胃火，祛“巴达干”“赫依”，促进 “分清别浊”功能，进一步调理由其功能失常所致“血不能分清浊”。

图2 药物-靶点-作用通路相互作用网络图

Fig.2Networkofcompounds-targets-pathwaysforPiperlongumL.againsthyperlipidemia

采用网络药理学，通过口服生物利用度和类药性两个关键参数筛选出15种有效成分，其中主要涉及酰胺类生物碱和挥发油类成分，其中胡椒碱(piperine)、荜茇宁(piperlonguminine)等在文献中明确记载能够治疗高脂血症。包兰兰等[16]研究胡椒碱对大白鼠血脂水平的影响。结果表明，胡椒碱可显著降低血清总胆固醇(TC)，对血清三酰甘油有一定的降低作用。BAO等[17]研究发现，荜茇宁通过调节肝脂肪代谢过程，可显著降低高脂血症大鼠血清三酰甘油，升高高密度脂蛋白胆固醇。其机制可能与上调羟甲基戊二酰辅酶A (hydroxy methylglutaryl coenzyme A reductase inhibitor HMG -CoA)、胆固醇7α-羟化酶(cholesterol 7α-hydroxylase, CYP7A1)、卵磷脂胆固醇脂酰基转移酶(lecithin-cholesterolacyltransferase，LCAT)、低密度脂蛋白受体(LDLR) 的mRNA及蛋白表达有关。

笔者通过有效成分得到荜茇治疗高脂血症相关的31个靶点，采用WebGestalt数据库和Metascape进行GO功能注释和Pathway通路富集分析，获得22条间接或直接与治疗高脂血症相关的通路。通过构建荜茇治疗高脂血症的“有效成分-靶点-作用通路”网络图，分析其中包括与脂质代谢相关、血小板聚集相关的通路为主要通路，从侧面说明了荜茇“分清别浊”功能可能通过主要成分与上述靶点相互作用，进而调控与脂质代谢和血小板聚集相关通路来实现，但进一步作用机制有待后续研究进一步说明。