EGFR和ErbB2表达对肺腺癌纵隔淋巴结转移的预测作用*

蒋萱， 罗佳，张晓月，黄玉胜，夏蕾,余娴，杨镇洲

400010重庆,重庆医科大学附属第二医院 肿瘤中心(蒋萱、张晓月、黄玉胜、夏蕾、余娴、杨镇洲)；400042重庆，陆军特色医学中心 肿瘤中心(罗佳)

肺癌在全世界范围内的男性及女性中，均是发病率最高(11.6%)且死亡率最高的肿瘤(18.4%)[1]。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)的治疗包括手术、化疗、放疗、靶向治疗、免疫治疗等。对于NSCLC患者需要采用局部及全身治疗相结合的综合治疗。对于Ⅰ～Ⅱ及ⅢA-N1期患者，以手术为主的治疗模式已形成广泛共识[2]，对于cN2的NSCLC患者，诱导化疗±放化疗或手术均是可供选择的方式[3]。对于放疗患者，放射性肺损伤(radiation induced lung injury，RILI)仍是影响疗效及损害患者生存质量的并发症[4]。确定纵隔淋巴结(medistinal lymph node，MLN)转移情况，不仅有助于制定治疗方案，也能提高靶区勾画的精确度，降低放射性肺损伤的发生。

近来的遗传学研究表明，原发肿瘤的基因表达谱微阵列预测分析(prediction analysis of microarray， PAM)可以预测非小细胞肺癌患者的淋巴结转移状态，N0患者中，基因表达谱微阵列预测分析 (prediction analysis of microarray， PAM)阳性的患者较PAM阴性的患者生存期更短，提示PAM可能比影像学更能准确地判断隐性淋巴结转移[5-6]。此外，一项针对NSCLC的cDNA序列的研究表明，预测腺癌和鳞癌淋巴结转移的基因截然不同[5]。这些研究揭示了差异表达基因(differentially expressed genen,DEG)对肿瘤相关生物学特性的预测功能及其与淋巴结转移之间的关系。通过生物预测因子来确认MLN转移状态将会是个体化治疗的一大重要进展。

为了探索表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)敏感突变的肺腺癌患者MLN转移的生物预测因子，我们前期的研究选取了10例EGFR突变肺腺癌患者[5例纵隔淋巴结转移(medistinal lymph node metastasis，MLNM)，5例无纵隔淋巴结转移(non-medistinal lymph node metastasis， NMLNM)]的石蜡切片，通过二代测序及生物信息学分析，发现EGFR高突变频率与ErbB2基因扩增可能可以作为肺腺癌MLN转移的预测因子(未发表)。

为了明确EGFR及ErbB2(表皮生长因子受体2)表达与EGFR突变的肺腺癌患者的MLNM的相关性，我们选取了通过手术确诊为肺腺癌且接受了MLN切除的患者，对其原发病灶标本进行了蛋白表达及mRNA分析。

1 材料与方法

1.1 临床病例资料

本回顾性研究选取2012～2018年间，在陆军特色医学中心进行原发病灶手术切除及MLN清扫,病理结果为腺癌的患者。通过突变扩增阻滞系统 (amplification refractory mutation system,ARMS)法或二代基因测序 (next generation sequential，NGS)检测患者表皮生长因子受体 (epidermal growth factor receptor,EGFR)突变情况。

1.2 免疫组化

检测肺部原发病灶EGFR以及ErbB2的表达。肿瘤组织在4%福尔马林中固定，室温过夜，脱水然后石蜡包埋。切片(RM2235，莱卡，德国)厚度4μm。实验步骤如下：1)60℃烤箱烤片过夜；2)脱水及脱蜡；3)滴加一抗(中杉金桥 EGFR TA-801933，ErbB2 TA-505802)，4℃孵育过夜；4)清洗后滴加二抗(SAP-9100羊抗兔/鼠)，37℃孵育25min;5)清洗后DAB显色；6)水洗终止染色，苏木素复染；7)分化及固定；8)封片[7]。用显微镜观察(10倍目镜×10倍物镜)依照细胞阳性着色程度(抗原含量)，可分为弱阳性(+)1分，中等阳性(++)2分，强阳性(+++)3分，依照阳性细胞数量可分为：弱阳性<25%记1分，中等阳性(25%～49%)记2分，强阳性≥50%记3分；两者相乘<3者为阴性，评0分；≥4且<6者为弱阳性，评1分；≥6者为强阳性，评2分。至少随机观察5～10HPF，取其均值[8]。EGFR在细胞质及细胞膜上表达，光学显微镜下观察为棕黄色颗粒，定位好，不扩散，细胞形态清晰且着色显著高于背景色[9]。ErbB2表达位于细胞膜[10]。

1.3 PCR

1.3.1 RNA的提取 RNA逆转录试剂盒提取石蜡组织中的RNA(依照thermofish K1622试剂盒操作流程)。

1.3.2 Real Time-PCR 利用Primerbank设计引物，GAPDH序列上游5’-CTGGCTACACTGAGCACC-3’，下游5’-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG -3’，EGFR序列 上游5’-AGGCACGATAACAAGCTCAC-3’，下游5’-ATGAGGACATAACCAGCCACC-3’，HER2序列上游5’- TGGCCTGTGCCCACTATAAG-3’，下游5’- AGGAGAGGTCAGGTTTCACAC-3’；运行条件：95℃ 预变性5min，95℃ 变性10s、60℃ 退火15s、72℃延伸、20s×44个循环。

1.4 统计学分析

运用SPSS18.0软件对实验所得数据进行分析。EGFR和ErbB2免疫组化强度与MLN转移率相关性采用卡方检验，必要时用Fisher确切概率法。有无MLN转移两组间其他连续变量如免疫组化评分、mRNA表达水平等比较采用Kruskal-Wallis检验。相关性采用Pearson相关性分析。所有检验均为双侧检验，检验水准为α=0.05。

2 结 果

2.1 临床数据

本研究共选取30例患者，其中男性12例，女性18例。Ⅰ期 15例，Ⅱ期 4例，Ⅲ期 11例[其中ⅢA期(N2)9例 ，ⅢB期2例 ] 。其中11例为MLNM，19例为 NMLNM。根据吸烟状态将患者分为3类：从不吸烟组(≤100支/一生)，曾吸烟组(>100支/一生且已戒烟≥1年)及吸烟组(>100支/一生并且戒烟<1年)[11]。PS评分0分、1分各15例。所有患者通过ARMS法或NGS均检测到EGFR基因突变。除分期外，其余基线数据在两组中差异均无统计学意义(表1)。

表1 入组患者的临床基线数据

Table 1. Characteristics of Patients

VariableMLNM(n=11)n(%)NMLNM(n=19)n(%)χ2PAge(median)55600.332Gender0.0060.938 Male5(41.7)7(58.3) Female6(33.3)12(66.7)Cancer stage28.229<0.001 Ⅰ0(0)15(100) Ⅱ0(0)4(100) Ⅲ11(100)0(0) Ⅳ0(0)0(0)Smoking history2.5220.373 No8(38.1)13(61.9) Yes (quited)2(25.0)6(75.0) Yes1(10.0)0(0)PS score0.1440.705 05(33.3)10(66.7) 16(40.0)9(60.0)

MLNM: Medistinal lymph node metastasis; NMLNM: Non-medistinal lymph node metastasis; PS: Performance status.

2.2 EGFR、ErbB2的蛋白表达与纵隔淋巴结转移的关系

在NMLNM的19名患者中，EGFR阴性表达占13例(68.42%)，弱阳性表达占6例(31.58%)，无强阳性表达的病例；在MLNM的11名患者中，7例(63.64%)EGFR阴性表达，1例(9.09%)EGFR弱阳性表达，3例(27.27%)EGFR强阳性表达，EGFR在两组中的表达差异有统计学意义(P=0.048)，其中，MLNM组中EGFG强阳性表达率高于NMLNM组，差异有统计学意义 (P=0.041)。在NMLNM的19名患者中，17例(89.47%)ErbB2阴性表达，弱阳性表达和强阳性表达分别为1例(分别为5.26%)，在11例MLNM患者中，4例(36.36%)ErbB2阴性表达，6例(54.55%)弱阳性表达，1例(9.09%)强阳性表达，ErbB2的表达在两组间存在差异有统计学意义(P=0.002)，MLNM组中ErbB2阳性表达率高于NMLNM组，差异有统计学意义 (P<0.001)(表2)。EGFR、ErbB2代表性表达情况见图1。

图1 EGFR、ErbB2蛋白在EGFR突变的肺腺癌中的表达情况(10×40)：

Figure1.ProteinExpressionofEGFRandErbB2inEGFR-MutatedLungAdenocarcinoma(10×40)

Panel A and B show the high expression of EGFR and ErbB2 in primary lesion (as indicated by the arrow); Panel C and D show the low expression of EGFR and ErbB2 in primary lesion (as indicated by the arrow); Panel E and F show the negative expression of EGFR and ErbB2 in primary lesion.

表2 EGFR、ErbB2蛋白表达与纵隔淋巴结转移之间的关系

Table 2. Correlation between Protein Expression of EGFR or ErbB2 and MLNM

VariableEGFR (%)χ2PErbB2 (%)χ2PIHC scoreNegativeWeaklypositiveHighly positiveNegativeWeaklypositiveHighlypositiveNMLNM(n=19)13(68.42)6(31.58)05.8290.04817(89.47)1(5.26)1(5.26)9.9220.002MLNM(n=11)7(63.64)1(9.09)3(27.27)4(36.36)6(54.55)1(9.09)IHC scoreNegative+Weakly positiveHighly positiveNegativePositiveNMLNM(n=19)19(100)06.6140.04117(89.47)2(10.52)12.539<0.001MLNM(n=11)8(72.73)3(27.27)4(36.36)7(63.64)

EGFR:Epidermal growth factor receptor; MLNM:Medistinal lymph node metastasis; IHC:Immunohistochemistry; NMLNM:Non-medistinal lymph node metastasis.

2.3 EGFR、ErbB2 PCR表达与纵隔淋巴结转移的关系

EGFR及ErbB2 mRNA 扩增倍数在NMLNM组中表达均较MLNM组高，但两者在NMLNM组与MLNM组中扩增倍数差异无统计学意义(P=0.108, 0.510)(图2)

图2 EGFR、ErbB2在MLNM及NMLNM中的转录水平

Figure2.mRNALevelofEGFRandErbB2intheMLNMGroupandtheNMLNMGroup

MLNM:Medistinal lymph node metastasis; NMLNM:Non-medistinal lymph node metastasis.

2.4 EGFR与ErbB2之间的相关性

EGFR蛋白与ErbB2蛋白表达之间存在相关性(r=0.975)，EGFR mRNA与ErbB2 mRNA扩增水平之间相关性较强(r=0.521)(表3)

表3 EGFR与ErbB2之间的相关性

Table 3. Correlation between EGFR and ErbB2

R (P)EGFR ErbB2EGFR mRNAErbB2 mRNAEGFR10.521 (0.003)-0.279 (0.135)-0.244 (0.193)ErbB20.521 (0.003)1-0.308 (0.097)-0.230 (0.222)EGFR mRNA-0.279 (0.135)-0.308 (0.097)10.975 (<0.001)ErbB2 mRNA-0.244 (0.193)-0.230 (0.222)0.975 (<0.001)1

EGFR:Epidermal growth factor receptor.

3 讨 论

放疗在N2及局部晚期NSCLC患者治疗中扮演着重要的角色[12]，放射性肺损伤是其常见的副反应，其发生与肺受照射体积等相关[13]。对于MLN是否转移及转移模式的评判不仅有助于治疗方案的制定，也对准确靶区勾画、减少放射性肺炎的发生、提高局控率及总生存率具有重要意义[14-15]。影像学检查是评估肺癌TMN分期的主要手段，而CT检查是评估纵膈淋巴结转移的主要非侵入方式。随着影像学的发展，越来越多的其他影像学手段也被用来评估淋巴结转移。一项针对122例非小细胞肺癌患者术前进行PET/CT及增强CT扫描对MLNM的前瞻性研究表明，PET/CT诊断MLNM的敏感性、特异性(分别为86%、85%)均显著高于CT(分别为69%、71%)，但对于NSCLC患者，直径小于10mm的伴有微小肿瘤侵犯的局部淋巴结，或者直径超过10mm的伴有增生或者其他炎性良性病变的局部淋巴结仍是PET/CT及增强CT的盲区[16]。弥散加权成像(DWI)可以在细胞学水平，通过表观扩散系数(ADC)来探测水分子在组织中受限扩散，近年来，被用于易于产生运动伪影的部位，例如纵隔。研究发现，DWI对于MLN检测与PET/CT相比，有助于淋巴结转移的诊断，但其假阴性结果仍影响其准确性[17]。而运用生物标志物预测淋巴结转移状态的研究早在90年代就已开始，虽然意大利科学家通过利用CEA与CT比较发现，前者对诊断MLNM的特异性与敏感性均无优势，但是随着分子水平标志物的推广，cDNA序列技术检测基因表达的效率提高，使得通过cDNA从杂乱无章的序列中筛选出有诊断价值的信息成为可能[18]。我团队致力于通过生物标志物预测MLN转移状态的研究，曾针对94例肺癌术后患者进行影像学及生物信息学研究，发现术前1月进行PET/CT及64排增强CT检查，其对MLNM的敏感性、特异性、准确率及阳性预测率均不高，而通过差异表达基因 (differentially expressed gene， DEG)进行高内涵筛选 (high content screening，HCS)得出的增殖和转移相关基因，可以作为影像学无法判断MLN有无转移时的补充[19]。而早在2004年，Takada等[5]已经从与鳞癌及腺癌都相关的1 289种基因中，发现了可以预测淋巴结转移的与鳞癌相关的23种基因(MSH6、HIF1A、MLH1、MMP8等)及与腺癌相关的43种基因(IL10RA、MAPK10、TP53、XRCC3等)，其准确率分别为100%和94%。我国的多项研究也表明，Beclin1、MUC4mRNA、IGF2等多个基因的表达对MLNM有预测作用[20-22]。由此可见，随着高通量测序的兴起，利用表达谱寻找与肿瘤发生、转移相关的基因，确定MLN转移预测因子的研究正在大力推广。基因检测通过对MLN转移状态的推测，来确认患者淋巴结的转移状态，从而可能制定更合理的治疗方案。

多个研究也报道EGFR强阳性表达可促进肿瘤增殖、血管生成、转移等，尤其是在乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌等癌症中，EGFR的强阳性表达与肿瘤转移相关。在非小细胞肺癌中，研究报道EGFR可能与Ki-67发挥协同作用，对MLNM转移产生影响[23]。另有报道发现：EGFR在原发灶中的表达在有淋巴结转移患者中高于无淋巴结转移的患者，这也体现了EGFR在肿瘤淋巴结转移中的作用[24]。我团队前期研究发现，EGFR高突变频率与ErbB2基因扩增可能可以作为肺腺癌MLN转移的预测因子，在此基础上，本研究进一步证实EGFR及ErbB2在蛋白水平阳性表达与NSCLC的MLN转移呈正相关，原发灶中EGFR强阳性表达及ErbB2阳性表达可能对肺腺癌MLN转移有预测作用(P值分别为0.041与<0.001)。

EGFR是第一个被发现其突变、过表达与肿瘤相关的基因家族，它共有四个结构相关因子，EGFR(HER1)、ErbB2(HER2/neu)，ErbB3(HER3)和ErbB4(HER4)，它们相互结合形成二聚体或异二聚体发挥作用，其中ErbB2不能结合EGFR的受体，因此不能形成二聚体，但两者激酶催化区域具有高度同源性和相似的生化动力学特性，因此两者的信号通路可以相互作用，在肿瘤发生中发挥协同作用；并且ErbB2基因的突变导致ErbB2胞外结构域缺失或者形成ErbB2/EGFR异二聚体，进而促进细胞增殖[25-26]。EGFR突变可以选择性激活下游PI3K/Akt和JAK/STAT通路，抵抗肿瘤细胞凋亡。EGFR激活突变可以积累EGR-TKI结构域(TKD)，进一步选择性激活下游信号通路导致EGFR表达上调，从而导致细胞增殖等。EGFR激活还可通过促进VEGF的释放作用于肿瘤和内皮细胞，导致血管生成增加，促进肿瘤转移[27-29]。而EGFR突变的肺腺癌患者接受EGFR-TKI或化疗，预后均较野生型患者好，体现了EGFR突变情况对肺腺癌患者预后的预测价值[30]，而突变情况不能代替EGFR蛋白表达情况，因此，本研究对EGFR突变的肺腺癌原发灶中EGFR、ErbB2蛋白的表达与MLN转移状态之间的关系进行研究，发现EGFR强阳性表达及ErbB2阳性表达在蛋白水平与MLN转移存在相关性，为EGFR、ErbB2作用生物信息学的靶点预测EGFR突变的肺腺癌纵隔淋巴结状态提供了理论依据，鉴于本研究样本数量，EGFR及ErbB2的敏感性和特异性还需大样本进一步验证。

通过相关研究我们推测，EGFR和ErbB2通过被配体激活，且持续介导下游信号通路传导，使两者在肿瘤发展及转移中发挥协同作用。EGFR与ErbB2如何影响下游信号通路介导纵隔淋巴结转移还有待进一步研究。

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