高效液相-柱后衍生-荧光检测法测定普瑞巴林含量

郭旭光

(河南省口岸食品检验检测所，郑州 450003)

普瑞巴林化学名为(S)-3-氨甲基-5-甲基己酸，是γ-氨基丁酸 (Gamma-aminobutyric acid，GABA)受体激动药，用于糖尿病性外周神经痛及带状疱疹后遗神经痛的治疗，以及成年患者部分性癫发作的辅助治疗[1]。普瑞巴林是GABA的三位异丁基取代物[2]，紫外吸收很弱且为末端吸收[3]，目前报道的高效液相紫外检测法都是采用205[4]或210 nm[3，5-6]为检测波长，在该波长处测定，不但吸收弱，且因为是末端吸收，会引起较大基线噪音，影响检测灵敏度。文献还报道其他普瑞巴林含量测定方法：高效液相柱前衍生紫外检测法[7]、高效液相蒸发光散射检测法[8]和高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS/MS)法[9]，上述方法操作均较繁琐。高效液相-柱后衍生-荧光检测法测定普瑞巴林的含量笔者未见报道，笔者研究并建立了高效液相-柱后衍生-荧光检测法测定普瑞巴林的含量，结果表明该方法操作简便，灵敏度高，专属性强，准确可靠，可以更好地测定普瑞巴林的含量。

1 仪器与试药

1.1仪器 Waters e2695高效液相色谱仪；2475 FLR Detector荧光检测器；Waters柱后衍生系统，Empower 3色谱工作站；梅特勒T5自动电位滴定仪；XPE205分析天平(梅特勒-托利多公司，感量：0.01 mg)。

1.2试药 普瑞巴林对照品(中国食品药品检定研究院，批号：101106-201001，含量：99.8%)；普瑞巴林(双鹤药业有限责任公司，批号：4003161002，4003161003，14003161004)；0.05%氢氧化钠(NaOH)溶液(Pickering公司，批号：CB130)，邻苯二甲醛(O-phthalaldehyde，OPA)稀释液(Pickering公司，批号：CB910)；甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1色谱条件及系统适用性实验 色谱柱：Waters C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-水(15：85)；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：λex334 nm，λem455 nm；柱温：35 ℃；进样量：20 μL；衍生剂流速：0.3 mL·min-1。

取线性关系测定所用对照品溶液、供试品溶液和空白溶剂，在上述色谱条件下进样，普瑞巴林保留时间约10.9 min，理论板数9658，空白溶剂无干扰，色谱图见图1。

2.2溶液的制备

2.2.1供试品溶液的制备 精密称取普瑞巴林约20 mg，置100 mL量瓶，加50%甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取5 mL置50 mL量瓶，加50%甲醇水稀释至刻度，摇匀，即得。

A.空白对照；B.对照品；C.供试品；1.普瑞巴林。

A.blank control；B.control；C.test sample；1.pregabalin.

Fig.1HPLCchromatogramsofthreekindsofsolution

2.2.2OPA衍生液的制备 在衍生瓶中加入邻苯二甲醛稀释液(CB910)945 mL，称取邻苯二甲醛溶液100 mg置于甲醇10 mL中，经孔径0.45 μm有机膜滤过，将滤液加入衍生瓶；将巯基乙醇2 g溶解在邻苯二甲醛稀释液5 mL中，孔径0.45 μm有机膜滤过，然后加入到衍生瓶，摇匀，即得。

2.3线性关系考察 取普瑞巴林对照品约40 mg，精密称定，置100 mL量瓶，加水使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为标准贮备液，精密吸取标准贮备液1.0，2.0，2.5，5.0，8.0，10.0 mL，分别置50 mL量瓶，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，按照以上色谱条件，分别进样20 μL，以普瑞巴林质量浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，计算得回归方程：Y=1.617E+08X-7.602E+07(r=0.999 5)，结果表明普瑞巴林在8～80 μg·mL-1范围内呈良好的线性关系。

2.4精密度实验 取样品(批号：4003161002)制备的供试品溶液，重复进样6次，记录峰面积，其峰面积RSD=0.56%。

2.5重复性实验 取同一批号样品(批号：4003161002)6份，分别按供试品溶液制备项下平行制备供试品溶液，按上述色谱条件进样，测定。结果表明样品中普瑞巴林平均含量99.72%，RSD=0.68%。

2.6稳定性实验 取样品(批号：4003161002)制备的供试品溶液，按上述色谱条件分别于0，2，4，6，8，12 h测定，其峰面积的平均值为3 162 708 584，RSD=0.26%。

2.7加样回收率实验 精密称取已知含量样品(批号：4003161002)适量，加入对照品适量，按“2.2”项配制成相当于含量测定浓度80%，100%，120%的供试品溶液各3份。按上述色谱条件，测定含量，计算回收率，结果见表1。平均加样回收率99.82%，RSD=0.80%。

表1 普瑞巴林加样回收率测定结果

2.8样品含量测定 取样品3批，依法制备供试品液，分别按照“2.1”项色谱条件测定其峰面积，标准曲线法计算含量，同时取上述3批样品各约0.1 g，用醋酸40 mL溶解，0.1 mol·L-1高氯酸滴定液电位滴定法测定含量。结果两种方法测定含量基本一致，见表2。

表2 两种方法样品含量测定结果比较

Tab.2Comparisonofcontentdeterminationonthesamplesbyusingtwomethods

批号本文方法含量RSD电位滴定法含量RSD400316100299.70.699.80.3400316100399.90.599.50.2400316100499.70.599.60.2

3 讨论

取上述对照品线性溶液，固定激发波长于330 nm处，在390～490 nm范围内扫描发射波长，结果在455 nm处有最大吸收；固定发射波长于455 nm处，在300～435 nm范围内扫描激发波长，结果在334 nm处有最大吸收。故检测激发波长定为334 nm，发射波长定为455 nm。

笔者在本实验中分别考察4种样品溶解溶剂：水[5]、甲醇[2]、50%乙腈[7]和50%甲醇，结果50%甲醇和50%乙腈相对水和甲醇能很好地溶解样品，且都能符合系统适用性专属性要求，考虑甲醇相对乙腈更经济且毒性小，本实验流动相组成又为甲醇-水系统，50%甲醇也能更好地降低溶剂效应，故选50%甲醇做溶剂。

笔者在本实验中考察了流动相：甲醇-乙腈-20 mmol·L-1磷酸盐缓冲液(pH值7.0)(350：100：550)[3]、水-乙腈(85：15)和水-甲醇(85：15)，结果3种流动相均能满足检测系统适用性要求，但第一种流动相组成响应相对较低，后两种流动相除了在保留时间有差别，峰型均对称尖锐，响应较好，考虑经济、简便，选择水-甲醇(85：15)作为流动相组成。本法操作简便、快速、准确、灵敏、专属性强，适用于普瑞巴林的含量测定。