应用体外仿生消化法对华贵栉孔扇贝体内镉进行生物可给率研究

2019-10-30杨妙峰郑盛华席英玉罗冬莲钟硕良

渔业研究 2019年5期

杨妙峰，郑盛华，席英玉，罗冬莲，钟硕良

(1.福建省水产研究所，福建省海洋生物增养殖与高值化利用重点实验室，福建厦门 361013；2.福建省海洋生物资源开发利用协同创新中心，福建厦门 361013)

镉(Cd)是已知的最易在体内蓄积的环境污染毒物之一，具有致病、致癌和致突变作用，半衰期长达10～35年，是影响水产品尤其是具高富集特性的滤食性贝类食用安全的主要污染物之一[1-2]。食品中的污染物经口摄入后仅有部分能通过消化作用从基质中释放出来，且只有释放出来的部分(即生物可给量)可对机体产生毒性作用，而目前现行的检测方法和限量标准主要针对的均是水产品中Cd的总量(即残留量)分析，污染物膳食暴露评估也多基于食品中污染物的污染水平(外暴露量)而非污染物经消化、吸收后到达组织产生毒性作用的剂量(内暴露量)，因此可能会过高估计污染物的暴露水平[3]。体外仿生消化法能够有效模拟胃肠道的物理化学环境，获得经口摄入的Cd进入人体后生物可给率的可靠数据[4]，但多见于鱼类[5]和藻类[6-7]等水产品食用风险的研究，而贝类体内重金属生物可给率的报道相对较少，如赵艳芳等[8]探讨了在胃肠仿生消化液作用下，栉孔扇贝和菲律宾蛤仔体内Cd的存在形态，并认为该结果对评估贝类中Cd的食用安全性具有积极意义；洪雄业[9]、蔡艳等[10]、王增焕等[11]也分别利用体外仿生消化法获得菲律宾蛤仔、缢蛏、鲍、牡蛎、血蚶等经济贝类体内微量金属元素的生物可给率并进行健康风险评价。

浅海贝类华贵栉孔扇贝(Chlamysnobills，以下简称扇贝)是对Cd富集能力较强、且抽检时Cd含量易超标的养殖贝类品种。本文以此为研究对象，采用体外仿生消化法，研究扇贝体内组织的消化食糜中Cd存在的主要形态及影响因子，并对扇贝不同部位组织中Cd的生物可给率进行分析，以期为扇贝的食用安全评价提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 仪器设备与试剂

仪器设备：原子吸收光谱仪(iCE 3500，ThermoFisher)，水浴恒温振荡器(THZ-82，常州国华电器有限公司)，高速离心机(5810R，Eppendorf)，微波消解仪(Mars 6，CEM)，pH/ISE测试仪(828型，Orion)，超纯水系统(Milli-Q element A10，Millipore)。ICP-MS(Agilent 7700x)，工作参数：射频功率1 550 W，等离子体气流速15 L/min，辅助气流速1.15 L/min，采样时间1 320 s。HPLC(Agilent 1260)，分离条件：Agilent Bio SEC-5分离柱(300 A，7.8 mm×300 mm)及Agilent SEC-5保护柱(300 A，7.8 mm×50 mm)，流速0.8 mL/min，进样量80 μL；流动相：10 mmol/L Tris-HCl缓冲液，其中加入0.1 mol/L NaCl和0.03% NaN3，调节pH=7.5，0.45 μm滤膜过滤，超声40 min除去溶解氧。通过G7205B等离子体色谱数据分析软件控制的触发接口实现HPLC和ICP-MS联机。

胰液素(效价1∶4 000)、胆汁、牛血清白蛋白、α-淀粉酶(活力≥4 000 U/g)、脂肪酶(活力≥30 000 U/g)、黏液素、尿酸、胃蛋白酶(效价1∶30 000)、金属硫蛋白(MT-Ⅱ，纯度≥95%)、还原性谷胱甘肽(GSH，纯度≥98%)和L型半胱氨酸(L-Cys，纯度≥98%)等生化试剂均购于上海一基实业有限公司；氢氧化钠、浓盐酸、浓硝酸为优级纯；其余试剂均为分析纯。GBW10024(GSB-15)扇贝成分分析标准物质作为Cd总量测定的质控样，购自地球物理地球化学勘查研究所。GSB G 62040-90(4801)Cd标准溶液购自国家钢铁材料测试中心钢铁研究总院。

MT-Ⅱ-Cd、GSH-Cd和Cys-Cd标准溶液配制：在氮气保护下，在MT-Ⅱ、GSH和Cys绝对过量的情况下加入Cd2+(螯合配比≥10∶1)，配制成200 μg/L(以Cd计)标准溶液用以确定保留时间。

1.2 样品制备

2014年7月—2018年4月从厦门、漳州市场分批购得10批次扇贝样品(S1～S10，各30只)。扇贝用超纯水冲洗3遍后滤纸吸干，去壳匀浆，于-20℃冷冻保存。随机选取其中6个扇贝样品，分别取闭壳肌、性腺、内脏、鳃瓣/外套膜等不同组织部位，并分别匀浆后于-20℃冷冻保存。

1.3 实验设计

根据文献配制体外仿生消化液[12]，称取约1～2 g扇贝样品(精确至0.001 g)，加入2.5 mL唾液37℃恒温振荡5 min，再加入15 mL胃液振荡2 h，最后加入30 mL十二指肠液和10 mL胆汁振荡7 h，8 000 r/min离心10 min(4℃)后取上清液用0.45 μm滤膜过滤，滤液(即仿生消化食糜)在4℃下保存待用，同步做消化食糜空白对照(Cd含量<0.2 μg/L)[8，12-13]。所有实验平行2份，取平均值。

1.4 微波消解及Cd含量测定

准确称取2 g贝类鲜样(精确至0.001 g)，加入10 mL浓HNO3静置过夜，微波消解后用石墨炉原子吸收光谱仪(iCE 3500)测定样品中Cd含量，同时做试剂空白对照。消化食糜用1% HNO3稀释相应倍数后测定Cd含量；消化残渣全量转移至消解罐，加入10 mL浓HNO3，微波消解后测定残渣态Cd含量。

质控样-GBW10024扇贝标准物质Cd含量测定结果为(1.11±0.04)mg/kg，符合参考值(1.06±0.10)mg/kg要求，表明石墨炉原子吸收法测定Cd含量的方法准确可靠。

1.5 扇贝体内Cd形态的测定

标准谱图(定性)：在氮气保护下，分别配制200 μg/L(以Cd计)的MT-Ⅱ-Cd、GSH-Cd和Cys-Cd三种螯合态Cd标准溶液，各进样40 μL，经HPLC分离后在ICP-MS进行测定，并随机选择一个扇贝消化糜样品进行Cd形态分析。

1.6 数据处理与分析

扇贝样品Cd的最大生物可给率以全过程仿生消化后Cd的溶出率予以表征，代表经胃肠道消化后Cd的最大释放率，而Cd的溶出率为Cd的生物可给量与样品含Cd总量的比值，即：

其中：C—消化食糜中溶解态Cd含量(μg/L)；V—消化食糜体积(L)；X—样品Cd含量(μg/g)；m—称样量(g)。

其中：mi—解剖后i组织的质量(g)，m0—全贝(去壳)质量(g)。

扇贝i组织对全贝消化靡Cd的贡献率(%)

使用Excel 2010和SPSS 18.0进行数据处理和图形制作。

2 结果

2.1 扇贝消化食糜中Cd的形态

MT-Ⅱ-Cd、GSH-Cd和Cys-Cd质谱图如图1所示。标准曲线(定量)：用200 μg/L(以Cd计)CdMT-Ⅱ-Cd绘制标准工作曲线，分别进样20、40、80 μL(Cd进样量x分别为0.004、0.008和0.016 μg)：Cd的响应值y=4 563 214x(μg)+2 449，R2=1.000 0，对MT-Cd进行定量分析。

扇贝消化食糜经HPLC分离后检测到2个Cd的信号峰(图2)，保留时间分别为14.3和15.6 min，根据1.5中MT-Ⅱ-Cd、GSH-Cd和Cys-Cd标准溶液在相同分离条件下的保留时间(图1，RT分别为14.5、15.6和16.4 min)，可判断14.3 min处为MT-Cd，15.6 min处为GSH-Cd。分别用HPLC-ICP-MS和原子吸收光谱仪测定CdMT-Cd和消化食糜的Cd含量，测定值分别为42.6(以Cd计)和47.6 μg/L，因此MT-Cd是扇贝消化食糜中Cd最主要的形态(约占89.5%)。

2.2 扇贝及不同组织中Cd的生物可给率

2.2.1 扇贝Cd的生物可给率

由图3可知，扇贝Cd含量范围为1.41～3.89 μg/g(均值2.77 μg/g)，(单位质量)生物可给量范围则为0.582～2.10 μg/g(均值1.31 μg/g)，Cd的生物可给率(溶出率)范围在36.5%～63.3%(均值47.9%)之间。其中Cd含量与生物可给率之间，Cd含量、生物可给率与生物学参数(长、宽、厚、体重)之间无统计学规律，相关性不强(P≥0.10)，个体差异明显。

2.2.2 不同部位组织Cd的生物可给率比较

扇贝不同组织Cd含量的分布规律为内脏>鳃瓣/外套膜≈闭壳肌>性腺(图4)，内脏Cd含量最高，约为其他组织的1.02～3.74倍(均值2.10倍)，(单位质量)生物可给量则为其他组织的0.74～3.77倍(均值1.95倍)，内脏和鳃瓣/外套膜中Cd的生物可给率略低于闭壳肌和性腺。同时，扇贝体内各组织受自身Cd含量、Cd可给率及质量分数共同影响，对消化糜中Cd含量的贡献率大小为闭壳肌>鳃瓣/外套膜>内脏>性腺(图5)，性腺最低，其余3种组织贡献率相差较小。总体而言，闭壳肌对消化糜中Cd的贡献率与其质量分数相当，鳃瓣/外套膜和性腺的略低于其质量分数，而内脏的贡献率则高于对应的质量分数，使得质量分数相近的内脏和性腺对消化糜中Cd的贡献率表现为内脏是性腺的2.32倍。

3 讨论

3.1 扇贝体内消化食糜中Cd存在的主要形态及其影响研究

扇贝消化食糜中Cd的形态主要是MT-Cd和GSH-Cd，MT-Cd是消化食糜中Cd最主要的形态。这可能是以下几种因素综合影响的结果：贝类体内Cd的积累和贮存形式包括可溶性细胞浆与不溶性颗粒细胞两大类，主要有与金属硫蛋白(类金属硫蛋白)或小分子量配位体(如GSH、Cys等)结合以及经细胞代谢后被亚细胞颗粒膜包裹成金属颗粒物等物质[14-16]。仿生消化时，Cd络合物在胃液强酸条件下(pH<1.2)发生解离，如50%Cd-MT发生解离的pH为2.5～3.5[17-18]，Cys-Cd在pH<4.0时也不能稳定存在(络合物极谱峰消失)[19]；随着肠消化阶段pH的升高(最终pH≈6.5)，在强酸性条件下解离出来的Cd将与消化食糜中的有机配体重新络合。由于MT在中性条件下的稳定性和对金属的螯合能力均优于GSH、Cys等小分子物质[20-21]，表现出对Cd绝对的螯合竞争力，因此消化食糜中Cd的主要形态为MT-Cd。赵艳芳等[8]发现扇贝体内的Cd主要以MT、GSH和Cys的络合态存在，仿生消化后，在胃提取液(酸性)中仅发现未知的小分子有机Cd(Cd-X)，在扇贝肠提取液(即消化食糜)中发现Cd的主要形态为MT-Cd也证明了这一点。另一方面，中性条件下Cd与MT的结合能力是Zn的104倍[22]，因此肠消化阶段Cd与有机配体重新络合时，也能竞争取代仿生消化前MT-Zn中的Zn，生成MT-Cd，从而增加MT-Cd在消化食糜中Cd含量的比例。因此，扇贝消化食糜中Cd的形态可能与贝类体内Cd的贮存形态、MT和GSH等有机配体及其Cd螯合物的稳定性、Cd离子与其他金属离子的竞争优势等因素有关。如图3所示，不同扇贝样品Cd生物可给率存在着个体差异，是否与贝类组织及消化糜中Cd的形态及分布有关，尚有待于进一步实验取证。

除了MT-Cd是消化食糜中Cd的主要形态外，与赵艳芳等[8]的实验结论略有不同的是，本实验消化食糜中还发现有少量GSH-Cd，而赵艳芳等发现的则是未知的Cd-X(分子量小于Cys-Cd)，这可能是因为后者制备的扇贝样品经过蒸熟步骤，蒸煮过程GSH会部分流失，加上仿生消化时，是将胃提取液取出约2/3再加入肠液和胆汁，因而消化食糜的最终pH值较高，导致GSH不易留存。

3.2 扇贝及不同组织中Cd的可给率比较及其影响研究

由于人体消化液组成和消化环境的多样性和复杂性，体外仿生消化尚无通用方法，pH、消化液组成、停留时间、固液比、是否经烹饪处理及烹饪处理方式等都是可给率的影响因素。本实验中，扇贝体内Cd的生物可给率在36.5%～63.3%(均值47.9%)之间，低于洪雄业测得的兴化湾养殖贝类缢蛏、菲律宾蛤仔、鲍鱼Cd可给率(范围为53.8%～68.4%，均值61.3%)[9]以及王增焕等得出的牡蛎和蛤仔Cd的可给率(分别为76.8%和87.7%)[11]，而蔡艳等得到的象山、舟山、宁海3个海区的牡蛎、缢蛏、血蚶熟贝Cd的可给率范围则在28.6%～69.6%之间[10]，除了与实验方案设计不同有关外(如因仿生唾液、胃液、肠液和胆汁比例不同导致消化食糜最终pH不同，而pH是Cd可给率重要的影响因素之一[13])，还可能由于贝类体内Cd的可给率本身具有种间差异，但这种差异是否与不同贝类体内Cd的贮存形态有关，仍需后续进一步开展相关研究。

如图5所示，扇贝闭壳肌、性腺、鳃瓣/外套膜和内脏对全贝Cd生物可给量的贡献率均值分别为34.1%、10.9%、29.5%和25.4%，变异系数分别为13.8、55.1、20.0和34.8，性腺和内脏变异系数较大可能与性腺和胃含物饱满度(分别用相应的质量分数表征)有关。用SPSS 18.0探究各组织质量分数与相应Cd可给率的关系(图6)，结果显示性腺质量分数与可给率呈显著负相关(R=-0.840，P<0.05)，内脏质量分数与可给率呈显著极正相关(R=0.996，P<0.01)，闭壳肌和鳃瓣/外套膜的质量分数则与可给率相关性较弱。扇贝属于浅海贝类，饵料来源主要是海水悬浮颗粒中的浮游植物和有机碎屑，而浮游植物对Cd的富集能力较强[23]，内脏质量分数越大，消化道中内容物越多，Cd的可给率越高，说明摄食可能是扇贝吸收Cd的主要途径。而性腺中Cd的可给率略高于其他组织，这可能是因为扇贝生殖系统对Cd污染的应激反应较敏感[14]，较高的可给率有利于Cd的转运和排出，这也可能是性腺Cd含量较低的原因。同时，鳃瓣/外套膜和内脏中Cd的可给率较低，则有利于Cd的解毒和贮存。