自噬相关基因LC3Ⅱ和LAMP-2a在鼻息肉中的表达及意义

梁成 陈智斌

Chen等[1]通过研究表明：CRSwNP组织中自噬表达下调，2015年齐君君等[2]发现鼻息肉组织的自噬相关基因及蛋白Beclinl-1表达下调、P62表达上调，CRSwNP组织中自噬水平降低。研究还发现，自噬水平的改变、缺陷以及功能障碍与呼吸道黏膜上皮损伤的形成、持续有着不可分割的联系[3-5]。推测自噬参与鼻窦炎鼻息肉的形成，LC3Ⅱ和LAMP-2a分别作为大自噬和分子伴侣介导的自噬中最常见的标志物，通过观察它们在鼻腔组织中的表达情况，有利于更深一步了解自噬与鼻窦炎鼻息肉的关系。

资料与方法

1 研究对象

选取本院CRSwNP患者鼻息肉组织以及鼻中隔偏曲患者下鼻甲组织（2016.08～2017.08），根据病理HE染色分成非嗜酸性粒细胞性鼻息肉组（mENP）10例（男8例，女 2例，年龄 33～66岁，平均 49.5岁），嗜酸性粒细胞性鼻息肉组（ENP）10例（男6例，女4例；年龄27～68岁，平均47.5岁），下鼻甲组（IT）10例(男 8例，女 2例；年龄 18～55岁，平均 36.5岁)。诊断标准参照中国慢性鼻窦炎诊断和治疗指南（2018）[6]。排除条件：术前1个月内接受抗生素及糖皮质激素治疗，或患有肿瘤、免疫缺陷及结核等严重全身疾病。该项目经本院伦理委员会同意，取得了充分的知情同意，并签署相关知情同意书。

2 主要试剂及方法

2.1 HE染色法

首先清洗组织标本，在常温条件下，用10%的中性缓冲福尔马林固定标本24h，脱水，石蜡包埋，连续2μm切片，HE染色，观察鼻息肉组织的整体细胞学构造。

2.2 免疫组化PV法

操作按照试剂盒 (福州迈新生物技术开发有限公司)说明书，将切片标本置于65℃烤箱烘烤2h，按序使用柠檬酸钠抗原修复液高压修复3min，过氧化氢阻断内源酶，一抗LC3Ⅱ抗体（英国Biorbyt公司，orb97657）及LAMP-2a抗体（美国Abcam公司，ab18528）工作浓度均为 1∶500，4℃冰箱孵育过夜，二抗37℃孵育25min，二氨基联苯胺(DAB)染色5min，苏木素复染5～10s，脱水透明封片。

2.3 免疫组化的评分

4个低倍镜(×200)视野中组织细胞呈棕黄色、棕褐色判定为阳性细胞，4个高倍镜(×400)视野中计数阳性细胞比例，依次为：无以及极少量为(-)得0分；0%～25%为(+)得 1分；25%～50%为(++)得 2分；大于50%～75%为(+++)得 3分；大于75%为(++++)得 4分。

3 统计分析

使用软件SPSS 20.0进行统计学分析。结果采用均数±标准差（±s）表示，首先使用 levene 检验方差的齐性和正态分布，用两个独立样本t检验（t＜50），P＜0.05表示差异有统计学意义。

结果

1 鼻息肉HE染色分型

鼻息肉由极度水肿的结缔组织形成，间质中可见不同程度的炎性反应细胞浸润，神经以及血管显著减少。选取4个高倍镜下视野并计算嗜酸性粒细胞（EOS）比例的平均值，高于10%则为ENP，低于10%则为 nENP[7]。见图 1，图 2。

图1 大量EOS浸润（400倍）

图2 少量EOS浸润（400倍）

2 免疫组化与统计学

2.1 标记蛋白定位

鼻息肉和下鼻甲黏膜中的LC3Ⅱ和LAMP-2a在细胞质和细胞膜中呈强阳性黄色表达，胞核也可以呈棕黄色染色。

2.2 蛋白质表达强度

LC3Ⅱ在IT组织中，上皮、腺体以及间质强表达（图3），在ENP组织中主要以上皮强表达为主，间质以及腺体少量表达（图4），在nENP组织中上皮、间质弱表达，腺体少量表达（图5）；LAMP-2a在IT组织中上皮、腺体强表达，间质少量表达（图6），在ENP组织中上皮、腺体、间质呈中等程度阳性表达（图7），在nENP组织中上皮呈弱表达，间质、腺体少量表达（图8）。

2.3 统计结果

见表 1～6。

图3 LC3Ⅱ在IT中的表达（200倍）

图4 LC3Ⅱ在ENP中的表达（200倍）

图5 LC3Ⅱ在nENP中的表达（200倍）

图6 LAMP-2a在IT中的表达（200倍）

图7 LAMP-2a在ENP中的表达（200倍）

图8 LAMP-2a在nENP中的表达（200倍）

表1 LC3Ⅱ免疫组织化学染色结果

表2 LC3Ⅱ在三组间两两比较

表3 LAMP-2a免疫组织化学染色结果

表4 LAMP-2a在三组间两两比较

表5 息肉组织中LC3Ⅱ和LAMP-2a的表达结果

表6 息肉组织中LC3Ⅱ和LAMP-2a检验及相关性

讨论

对于鼻息肉的形成，目前认为主要与感染、变态反应、超抗原、生物膜、解剖异常以及基因表达异常等多重因素有关[8，9]。有限的研究表明，鼻息肉的自噬降低了[10]，而异常的自噬行为可导致鼻息肉的形成。自噬是一个高度保守的分解代谢过程，包括蛋白质聚集物、损伤的细胞器（线粒体、内质网等）以及各种病原体的自溶体降解，它代表一种适应性反应，以维持细胞和组织内的稳态，应对众多的细胞压力。

自噬主要包括大自噬、小自噬和分子伴侣介导的自噬。LC3Ⅱ是监测大自噬水平稳定可靠的特异性标志物，其含量在一定程度上反映了自噬的数量，随着自噬体膜的增加和LC3II表达的增加[11]，LC3II含量与自噬活性呈正相关，其含量可间接反映自噬水平[12]。正常情况下胞浆内的蛋白以及细胞器在胞浆中大致呈整体均匀分布，而本组实验中在高倍镜(×400)视野下观察鼻息肉组织时，可见大量棕色点状聚集形成于鼻息肉假复层纤毛上皮细胞胞浆以及胞核内，说明机体在受到损害时细胞自噬活动增加，细胞胞浆中LC3Ⅱ蛋白呈明显的点状或斑块聚集，从形态学上表明自噬水平上调，但是又比正常下鼻甲组组织的表达强度明显低，故鼻息肉组织的自噬水平较鼻甲组织是下降的，尤其在非嗜酸性粒细胞性鼻息肉组织中表现明显。通过实验数据分析：首先，LC3Ⅱ在IT组的表达水平高于鼻息肉（nENP+ENP）组，显示了鼻腔组织从鼻甲黏膜到鼻息肉的形成过程中，大自噬水平是降低的或是不足，但两者之间表达强度差异并没有统计学意义；其次，三组间两两比较发现IT组和nENP组的表达强度差异有统计学意义，而IT组和ENP组的表达强度差异却没有统计学意义，所以推测大自噬在鼻息肉组织中的下降仅仅出现在nENP组织中，ENP组织中大自噬的水平可能并不受影响，这不同于以往研究中关于鼻息肉中自噬水平下降这一相对笼统的观点；进一步的分析nENP和ENP组织中LC3Ⅱ的表达差异发现，nENP的表达量显著低于ENP，且两者的差异有统计学意义，推测EOS的浸润可能会上调鼻息肉组织中的大自噬水平，诱导炎症反应，临床上即表现为EOS的浸润加重了鼻息肉组织的炎症。事实上在很多炎症、肿瘤的形成过程中，自噬都表现出降低的情况，但是，Yoshioka等揭示了在食道和胃肠恶性肿瘤中LC3II表达明显高于癌旁组织。因此推测不同类型疾病形成LC3Ⅱ表达及作用各不相同。LAMP-2a是分子伴侣介导自噬（chaperonmediated autophagy,CMA）降解底物蛋白中含量最高的标志物，反映CMA的活性。一般情况下，CMA在轻度氧化应激作用下被激活时，LAMP-2a可表现出上调[13]，而本组实验中在高倍镜(×400)视野下观察鼻息肉组织时，细胞胞浆中LAMP-2a蛋白呈明显的点状或斑块聚集，从形态学上表现出和LC3Ⅱ相似的情况。本研究发现，由于仅IT组和nENP组的表达强度差异有统计学意义，IT组和NP组、IT组和ENP组、nENP和ENP的表达强度差异均没有统计学意义，所以推测CMA在鼻息肉组织中的下降也仅仅出现在nENP组织中，但与EOS的浸润可能会上调鼻息肉组织中的大自噬水平不同，EOS的浸润并不影响鼻息肉组织中CMA的表达。

从本次实验LC3Ⅱ与LAMP-2a的联合检测中能够更完整推测：在炎症、缺氧等条件刺激下，鼻息肉上皮细胞的自噬活动被激发增强，当这种激发增强的自噬不足以清除上皮细胞内的有害物质时，可能会诱发鼻息肉的逐步形成，从而表现出自噬活性的降低，在鼻息肉组织中LC3Ⅱ的表达水平（2.85±0.87）显著高于 LAMP-2a（1.15±0.81），且它们之间的差异有统计学意义，显示在鼻息肉组织的自噬路径中，大自噬起到主导作用，CMA因其不具有特异性而表现出其从属性。所以在不同的微环境条件下，它们可能被同时激活彼此间既有交融也有相对独立的发挥空间。然而，迄今为止，大自噬和CMA参与鼻息肉形成的具体过程却尚未见报道，但是可以确定的是自噬与许多慢性炎症疾病有关。研究表明,自噬可以调节炎症小体的活化，抑制炎性细胞因子IL-1β和IL-18的产生，诱导鼻黏膜上皮细胞自噬不足，通过激活凋亡通路,诱导上皮细胞凋亡，在病理情况下，凋亡细胞过多，特别是呼吸道上皮细胞缺失如鼻黏膜上皮细胞损伤和缺失，会引起上皮细胞屏障功能的损伤。同时也为细菌、病毒以及有害物质的入侵提供了便利条件和入口，引起黏膜下炎症细胞及炎症因子的聚集，它导致慢性鼻窦炎慢性黏膜下炎症的持续存在。鼻息肉组织中缺乏自噬，导致鼻息肉组织来源的成纤维细胞COX-2产生促炎症介质，组织结构重塑也导致慢性炎症持续。嗜酸性粒细胞也可产生细胞因子、ECP、MBP等，加重其微环境结构特征的炎症反应，后者可影响鼻腔上皮细胞的钠离子通道，导致钠离子吸收增加，组织水肿，鼻息肉的生长和增多，实验显示EOS的浸润会导致息肉组织中的自噬水平提高，即表现为更重的炎症反应，进一步证实了嗜酸性粒细胞鼻息肉有更加严重的临床表现这一事实[14]。鼻息肉病以持续炎症为特征，但发病机制复杂，尚存在争议。自噬能否成为治疗鼻息肉的手段目前完全是未知的。近些年来，针对调控自噬的靶向治疗药物成为了耳鼻喉科医生研究的热点，研究发现地塞米松诱导编码应激反应蛋白Dig2、RTP801、REDDl的基因的表达[15]，而 Dig2、RTP801、REDDl(mTOR 信号通路的负调节物)的升高能够诱导自噬。因此，地塞米松提高了自噬基因的表达[16]，减轻息肉炎症反应，临床试验也证实皮质类固醇类药物洗脱鼻窦植入物对ENP的治疗表现出显著的疗效[17]。

综上所述，nENP组织中自噬水平呈整体性下降，细胞内免疫防御机制失调，进而胞外激发免疫细胞特异性识别，导致鼻腔组织炎症发生以及持续，而EOS的浸润可能会提高鼻息肉组织中的大自噬水平，也即增强了鼻息肉组织的炎症反应。